专利名称：一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶、其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶(ILs-PAG)、其制法和用途，具体地说，所述离子液体-聚丙烯酰胺凝胶中的离子液体(ILs)为阳离子上烷基碳链碳原子数<4 的离子液体，属于蛋白质分离分析技术领域。
背景技术：
自从人类基因组测序完成后，蛋白质组学研究得到了广泛的关注。近几年来，蛋白质组学研究广泛应用于基础生命科学、医学分析和疾病标志物研究等领域。完整的蛋白质组学分析包括样品制备、蛋白质分离、蛋白质分析鉴定和表征四个部分，其中蛋白质分离和分析技术是蛋白质组学研究的关键，制约着蛋白质组学研究的发展。从1967年shapizo提出十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)起， SDS-PAGE作为一种经典的蛋白质分离分析技术，广泛应用于生物分离和蛋白质组学领域。 SDS-PAGE的基本原理是蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDQ结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，能消除不同蛋白质分子之间的电荷差异，从而使得蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶 (PAG)中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子质量的大小，其迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系。SDS-PAGE的这种性质可以实现蛋白质的有效分离，并可以利用迁移距离和蛋白质分子量之间的关系对蛋白质进行定性研究。但是， 对于分子量相等或相近的不同蛋白质，SDS-PAGE并不能对其实现有效的分离和鉴定。离子液体，又称室温离子液体或室温熔融盐，是指在室温或接近室温下呈现液态的融盐，通常由有机阳离子和无机阴离子构成。离子液体不但具有传统有机溶剂的优势，而且具有许多独特的优点，如在室温条件下蒸汽压低、不可燃、稳定性好、溶解能力强和导电性高等。最重要的是，离子液体可以通过改变阳离子和阴离子的种类定向改变离子液体的理化性质，成为一种可设计的溶剂。通过在离子液体中的阳离子上引入一些具有特殊作用的功能基团，还可以设计出具有特殊功能的离子液体。正因如此，近几十年来，离子液体广泛应用于生物分离分析领域。已有成功利用离子液体改进蛋白质分离分析技术的相关方法报道。例如，文章 "Simultaneous separation of basic and acidic proteins using l-butyl-3-methyl imidazoliumbased ion liquid as dynamic coating and background electrolyte in capillary electrophoresis" (D0I 10.1002/elps. 200700746，2008，29，2356 2362)介绍的方法，利用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐作为毛细管电泳电解质的添加剂，在14分钟内成功基线分离五种不同性质的蛋白质。该方法中，离子液体可以动态涂覆在毛细管内壁表面，改变内壁的电荷性质，从而降低毛细管内壁对碱性蛋白质的吸附作用。到目前为止，关于离子液体应用于改善SDS-PAGE以及其他凝胶分离技术的方法还没有报道，而本发明正好解决了这一问题
发明内容
针对SDS-PAGE方法对分子量相等或相近的不同蛋白质分离度低的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶；具体地说，所述离子液体-聚丙烯酰胺凝胶中的离子液体为阳离子上的烷基碳链碳原子数< 4的离子液体。本发明的目的之二在于提供一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的制备方法。本发明的目的之三在于提供一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的用途，所述用途是将离子液体-聚丙烯酰胺凝胶用于电泳分析蛋白质，即离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(ILs-SDS-PAGE)。使用所述电泳方法电泳分离经SDS处理后的蛋白质，对分子量相等或相近的不同蛋白质可实现快速、简便、绿色且高效的分离。为实现本发明的目的，采用的技术方案如下。一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，所述凝胶由离子液体和聚丙烯酰胺凝胶配方共同组成，即一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，主要包括单体、交联剂、凝胶缓冲体系、催化剂和加速剂，其特征在于还包括离子液体。其中，所述离子液体为阳离子上烷基碳链碳原子数< 4的离子液体，包括但不限于烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体。所述离子液体的质量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/v)。所述聚丙烯酰胺凝胶配方为本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶配方，包括但不限于以下组分单体、交联剂、凝胶缓冲体系、催化剂和加速剂；其中，各组分包括但不限于单体丙烯酰胺、交联剂N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺、凝胶缓冲体系、催化剂过硫酸铵(APS)和加速剂N，N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)。其中所述凝胶缓冲体系为本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶缓冲体系中的一种，包括但不限于 Tris-HCl缓冲体系、硼砂-硼酸缓冲体系或磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲体系。各组分的质量浓度同为本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶配方各组分质量浓度，根据实际需要确定。本发明所述离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的凝胶体系为连续凝胶体系或不连续凝胶体系，与本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶体系相同。包括但不限于连续凝胶体系的聚丙烯酰胺凝胶中的丙烯酰胺和N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺质量浓度为4 17% (w/v)，pH值为5. 8 8. 8 ；不连续凝胶体系中分离胶和浓缩胶中的丙烯酰胺和N， N’-亚甲基双丙烯酰胺质量浓度为4 17% (w/v)，其中分离胶浓度大于浓缩胶浓度，pH值为 5. 8 8. 8。所述离子液体的质量浓度根据需分离的目的蛋白质的主要分子量和凝胶浓度决定。其中，所述蛋白质为本领域在蛋白质分离分析中SDS-PAGE所适用的蛋白质，包括但不限于蛋白质分子量Marker和分子量低于66. 2KDa的人血清蛋白质生物样品。对于蛋白质分子量Marker，使用本发明提供的质量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/ ν)的烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体制备的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，可成功分离。对于人血清样品中分子量范围在66.2 沈.OKDa的蛋白质，使用本发明提供的质量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/v)的烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶分离，与其平行对照实验SDS-PAGE比较，提高了蛋白质的分离度，增加了分子量相近区域的清晰蛋白质条带个数。其中，所述蛋白质的分离度和条带个数随着离子液体浓度增加而增加。优选使用质量浓度为1.0% (w/v)的吡啶类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，此时分离的蛋白质获得最佳的分离条带个数和分离度。对于人血清样品中分子量范围在26. 0 12. OKDa的蛋白质，使用质量浓度范围为 0.3 1.0% (w/v)的烷基碳链碳原子数<4的咪唑类、吡啶类和吡咯烷类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶分离，与其平行对照实验SDS-PAGE比较，提高了蛋白质的分离度，可增加分子量相近区域的清晰蛋白质条带个数。其中，蛋白质分离度和条带个数随着离子液体浓度增加而增加。优选使用质量浓度为1.0% (w/v)的吡啶类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，此时所分离蛋白质获得最佳的分离条带个数和分离度。一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，所述方法步骤如下先将离子液体、单体、交联剂和凝胶缓冲体系混合得到混合溶液，再将催化剂和加速剂加入所述混合溶液混合均勻，凝固后，即可得到本发明所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶。其中，所述离子液体为阳离子上烷基碳链碳原子数< 4的离子液体，包括但不限于烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体。所述离子液体的质量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/v)。除离子液体外，本发明所述离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的其他制备方法为本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶制备方法。包括但不限于先将适当比例的离子液体、单体、交联剂和凝胶缓冲体系混合得到混合溶液，再将催化剂和加速剂加入所述混合溶液混合均勻，凝固后，即可得到本发明所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶。包括但不限于先将适当比例的离子液体、单体丙烯酰胺、交联剂N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺和凝胶缓冲体系混合得到混合溶液，再将催化剂过硫酸铵和加速剂N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺加入所述混合溶液混合均勻，凝固后，即可得到本发明所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶。其中所述凝胶缓冲体系为本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶缓冲体系中的一种，包括但不限于Tris-HCl缓冲体系、硼砂-硼酸缓冲体系或磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲体系。其中单体、交联剂和凝胶缓冲体系、催化剂和加速剂的质量浓度同为本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶配方各组分质量浓度，根据实际需要确定。本发明所述离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的凝胶体系为连续凝胶体系或不连续凝胶体系，与本领域在蛋白质分离分析中通用的聚丙烯酰胺凝胶体系相同。包括但不限于连续凝胶体系的聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺和N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺的质量浓度为4 17% (w/v)，pH值为5. 8 8. 8 ；不连续凝胶体系中分离胶和浓缩胶中的丙烯酰胺和N， N’-亚甲基双丙烯酰胺质量浓度为4 17% (w/v)，其中分离胶浓度大于浓缩胶浓度，pH值为 5. 8 8. 8。所述离子液体的质量浓度根据需分离的目的蛋白质的主要分子量和凝胶浓度决定。其中，所述蛋白质为本领域在蛋白质分离分析中SDS-PAGE所适用的蛋白质，包括但不限于蛋白质分子量Marker和分子量低于66. 2KDa的人血清蛋白质生物样品。对于蛋白质分子量Marker，使用本发明提供的质量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/ ν)的烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体制备的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，可成功分离。对于人血清样品中分子量范围在66.2 沈.OKDa的蛋白质，使用本发明提供的质
6量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/v)的烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶分离，与其平行对照实验SDS-PAGE比较，提高了蛋白质的分离度，增加了分子量相近区域的清晰蛋白质条带个数。其中，所述蛋白质的分离度和条带个数随着离子液体浓度增加而增加。优选使用质量浓度为1.0% (w/v)的吡啶类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，此时分离的蛋白质获得最佳的分离条带个数和分离度。对于人血清样品中分子量范围在26. 0 12. OKDa的蛋白质，使用质量浓度范围为 0. 3 1. 0% (w/v)的烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类、吡啶类和吡咯烷类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶分离，与其平行对照实验SDS-PAGE比较，提高了蛋白质的分离度，可增加分子量相近区域的清晰蛋白质条带个数。其中，蛋白质分离度和条带个数随着离子液体浓度增加而增加。优选使用质量浓度为1.0% (w/v)的吡啶类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，此时所分离蛋白质获得最佳的分离条带个数和分离度。一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的用途，所述用途是将离子液体-聚丙烯酰胺凝胶用于电泳分析蛋白质，即离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述电泳方法步骤如下(1)制备一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶；(2) SDS预处理蛋白质样品；(3)配制蛋白质电泳缓冲液并上样；(4)电泳；(5)染色和脱色。其征在于所述电泳所使用的凝胶为本发明所述的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶， 其余电泳条件同本领域在蛋白质分离分析中SDS-PAGE所适用的电泳条件。具体地说，所述电泳方法包括但不限于(1)制备离子液体-聚丙烯酰胺凝胶组装玻璃板制胶架，优选用凡士林密封制胶架玻璃板的两边和底部，防止漏液；若是连续凝胶体系，先将离子液体、单体、交联剂和凝胶缓冲体系混合得到混合溶液，再将催化剂和加速剂加入所述混合溶液混合均勻后得离子液体-聚丙烯酰胺凝胶溶液，将所述凝胶溶液注入胶架的玻璃板中，之后将梳子插入玻璃板中的凝胶溶液中，直至凝胶凝固，将梳子拔出，形成进样孔；若是不连续凝胶体系，需要分别制作分离胶和浓缩胶，方法与连续凝胶胶体系类似。(2)预处理蛋白质样品在蛋白质样品中加入样品缓冲溶液，混合均勻后加热，然后冷却，得到预处理蛋白质样品。其中，优选在95°C水浴加热5min，室温下冷却；蛋白质样品的质量浓度优选为 0. 1 0.5mg/mL;样品缓冲液包括但不限于缓冲体系、SDS、甘油、溴酚蓝、β-巯基乙醇和水，SDS与蛋白质样品的质量比>1.45 1 ；连续凝胶体系中，样品缓冲液缓冲体系的种类、 浓度和PH值与离子液体-聚丙烯酰胺凝胶体系的凝胶缓冲体系相同；在不连续凝胶体系中，样品缓冲液缓冲体系的种类、浓度和PH值与离子液体-聚丙烯酰胺凝胶体系浓缩胶溶液的凝胶缓冲体系相同。(3)配制蛋白质电泳缓冲液并上样组装电泳仪，配制蛋白质电泳缓冲液并加入电泳槽中；倒入蛋白质电泳缓冲液没过胶架玻璃板的短板，利用微量进样器将经步骤(2)预处理后的蛋白质样品注入孔道上样。其中，蛋白质样品的上样体积优选为5 10 μ L。连续凝胶体系中，电泳缓冲液缓冲体系的种类、浓度和PH值与离子液体-聚丙烯酰胺凝胶体系的凝胶缓冲体系相同；在不连续凝胶体系中，电泳缓冲液缓冲体系的种类、浓度和PH值与离子液体-聚丙烯酰胺凝胶体系浓缩胶溶液的凝胶缓冲体系相同。(4)电泳接通电泳仪进行电泳。连续凝胶体系，采用恒压电泳。不连续凝胶体系首先用低电压进行浓缩，当溴酚蓝到达分离胶和浓缩胶的分离界限，改用相对高的电压进行电泳分离， 直至溴酚蓝到达凝胶底端，电泳结束。其中，连续凝胶体系中，电压为80 200V ；不连续凝胶体系中，浓缩胶的电压一般为80 140V，分离胶的电压为100 160V。(5)染色和脱色电泳结束后，将凝胶从玻璃板上剥下，用水清洗后，进行染色，染色完成后进行脱色处理，直至去掉背景底色。优选在水中将凝胶从玻璃板上剥下，以防止凝胶破裂。其中染色为本领域在蛋白质分离分析中所适用的染色技术，包括但不限于考马斯亮蓝R250染色法、考马斯亮蓝G250染色法或银染法。所述离子液体的质量浓度根据需分离的目的蛋白质的主要分子量和凝胶浓度决定。其中，所述蛋白质为本领域在蛋白质分离分析中SDS-PAGE所适用的蛋白质，包括但不限于蛋白质分子量Marker和分子量低于66. 2KDa的人血清蛋白质生物样品。对于蛋白质分子量Marker，使用本发明提供的质量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/ ν)的烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体制备的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶进行离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可成功分离。对于人血清样品中分子量范围在66.2 沈.OKDa的蛋白质，使用本发明提供的质量浓度范围为0. 05 1. 0% (w/v)的烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶进行离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，与其平行对照实验SDS-PAGE比较，提高了蛋白质的分离度，增加了分子量相近区域的清晰蛋白质条带个数。其中，所述蛋白质的分离度和条带个数随着离子液体浓度增加而增加。优选使用质量浓度为1.0% (w/v)的吡啶类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，此时分离的蛋白质获得最佳的分离条带个数和分离度。对于人血清样品中分子量范围在26. 0 12. OKDa的蛋白质，使用质量浓度范围为 0.3 1.0% (w/v)的烷基碳链碳原子数<4的咪唑类、吡啶类和吡咯烷类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶进行离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，与其平行对照实验 SDS-PAGE比较，提高了蛋白质的分离度，可增加分子量相近区域的清晰蛋白质条带个数。其中，蛋白质分离度和条带个数随着离子液体浓度增加而增加。优选使用质量浓度为1.0% (w/v)的吡啶类离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，此时所分离的蛋白质获得最佳的分离条带个数和分离度。
有益效果1.简单、快速、高效和重现性好。本发明在聚丙烯酰胺凝胶配方基础上添加阳离子上烷基碳链碳原子数< 4的离子液体，制备得到一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶；在 SDS-PAGE方法的基础上，利用离子液体对SDS-PAGE的方法进行改进，使用离子液体_十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离蛋白质，具有简单、快速、高效和重现性好的优点。SDS-PAGE是经典的蛋白质分离分析技术，方法成熟，简单易操作，广泛应用于蛋白质研究的各个领域。利用离子液体改进SDS-PAGE的离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳同样简单易操作，并且相对于SDS-PAGE，离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质具有更高的分离度；2.制胶过程不易产生气泡。由于本发明中的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶不添加 SDS，减少了因SDS形成的气泡，方便将凝胶溶液转移到胶架的玻璃板中，也减少了凝胶凝固过程中气泡的产生，使电泳环境更加稳定；3.对蛋白质的选择性分离。SDS-PAGE对于相等或相近分子量的不同蛋白质，并不能实现有效分离。利用本发明提供的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，由于离子液体-聚丙烯酰胺凝胶中具有的离子液体可以与蛋白质相互作用，从而影响蛋白质的迁移速率，实现分子量相近蛋白质的分离；采用本发明提供的离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以实现对于相等或相近分子量的不同蛋白质的较好选择性分离，尤其对分子量低于66. 2KDa的人血清蛋白质具有高效的选择性分离。4.安全性。离子液体安全无污染，被称为绿色溶剂，不会对人体和环境产生危害；5.普适性。本发明提供的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶以及对应建立的离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，可以直接应用于蛋白质分离，还适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳方法的改进，有望成为蛋白质组学及蛋白质分离分析的重要技术；6.防止凝胶破裂。在本发明提供的离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤( 中，在水中将离子液体-聚丙烯酰胺凝胶从玻璃板上剥下，可以防止凝胶破裂；7.防止漏液。在本发明提供的离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤(1)中组装制胶架时，用凡士林密封制胶架玻璃板的两边和底部，可以防止漏液。
图1为离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法示意图。图2为实施例1制备得到的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐质量浓度为0. 05% (w/v)、0· 1 % (w/v)、0· 2 % (w/v)、0· 3 % (w/v)、0· 6 % (w/v)和 1· 0 % (w/v)的 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐-聚丙烯酰胺凝胶ac2mim]BF4-PAG)电泳分离蛋白质分子量 Marker的电泳图。图3为实施实例1制备得到的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐质量浓度为0.05% (w/v)、0· 1% (w/v)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v)和 1· 0% (w/v)的 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐-聚丙烯酰胺凝胶([C4mim]BF4-PAG)电泳分离蛋白质分子量Marker的电泳图。
图4为实施例2制备得到的溴化N- 丁基-3-甲基吡啶质量浓度为0. 05% (w/v) 的溴化N-丁基-3-甲基吡啶-聚丙烯酰胺凝胶([C4mpd] Br-PAG)、溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷质量浓度为0.05% (w/v)的溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷-聚丙烯酰胺凝胶([C4Hiprd] Br-PAG)和溴化1- 丁基-3-甲基咪唑质量浓度为0. 05% (w/v)的溴化1- 丁基-3-甲基咪唑-聚丙烯酰胺凝胶([C4mim]Br-PAG)分离十倍稀释的人血清的电泳图和其平行对照实验 SDS-PAGE分离十倍稀释的人血清的电泳图。图5为实施例2制备得到的溴化N- 丁基-3-甲基吡啶质量浓度为0. 3%的溴化 N- 丁基-3-甲基吡啶-聚丙烯酰胺凝胶([C4mpd]Br-PAG)、溴化N- 丁基-3-甲基吡咯烷质量浓度为0.3%的溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷-聚丙烯酰胺凝胶([C4Hiprd] Br-PAG)和溴化1- 丁基-3-甲基咪唑质量浓度为0. 3%的溴化1- 丁基-3-甲基咪唑-聚丙烯酰胺凝胶 ([C4mim]Br-PAG)分离十倍稀释人血清的电泳图和其平行对照实验SDS-PAGE分离十倍稀释人血清的电泳图。图6为实施例2制备得到的溴化N-丁基-3-甲基吡啶质量浓度为1.0%的溴化 N- 丁基-3-甲基吡啶-聚丙烯酰胺凝胶([C4mpd]Br-PAG)、溴化N- 丁基-3-甲基吡咯烷质量浓度为1.0%的溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷-聚丙烯酰胺凝胶([C4Hiprd] Br-PAG)和溴化1- 丁基-3-甲基咪唑质量浓度为1. 0%的溴化1- 丁基-3-甲基咪唑-聚丙烯酰胺凝胶 ([C4mim]Br-PAG)分离十倍稀释人血清的电泳图和其平行对照实验SDS-PAGE分离十倍稀释人血清的电泳图。
具体实施例方式为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。实施例1分别制备1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐质量浓度为0. 05% (w/v)、0. 1% (w/ ν)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v) ^P 1.0% (w/v)的 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐-聚丙烯酰胺凝胶([C2mim]BF4-PAG)和1_ 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐质量浓度为 0. 05% (w/v)、0· 1% (w/v)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v)和 1· 0% (w/v)的 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐-聚丙烯酰胺凝胶([C4mim]BF4-PAG),使用所述凝胶分别对蛋白质分子量Marker进行离子液体-十二烷基硫酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。方法如图1所示。所述凝胶的制备方法及电泳方法如下(1)制备离子液体-聚丙烯酰胺凝胶分别制备1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐质量浓度为0. 05% (w/v)、0. 1% (w/ ν)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v) ^P 1.0% (w/v)的 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐-聚丙烯酰胺凝胶([C2mim]BF4-PAG)和1_ 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐质量浓度为 0. 05% (w/v)、0· 1% (w/v)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v)和 1· 0% (w/v)的 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐-聚丙烯酰胺凝胶([C4mim]BF4-PAG)，其中分离胶中丙烯酰胺和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的质量浓度为14% (w/v)，浓缩胶中丙烯酰胺和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的质量浓度为5. 0% (w/v)。组装制胶架使用10X7. 2X0. Icm的制胶玻璃板， 首先将玻璃板两块洗净吹干，用适量的凡士林密封玻璃板的两边和底部，防止漏液。配制分离胶不同的IOmL容量瓶中分别加入如表1所示质量的离子液体、1. 46g丙烯酰胺、40mg N，N，-亚甲基双丙烯酰胺和454mg Tris-base，加水至&iiL，用6mM的HCl调pH值至8. 8， 用水定容至IOmL ；混合均勻后，转移至离心管中，加入100 μ L当天配制的10%过硫酸铵和 5yL的Ν，Ν，Ν' ,N'-四甲基乙二胺，振荡混合20s，混合均勻后超声脱气10s，得到分离胶溶液；将5mL分离胶溶液注入玻璃板，水封凝固，等到分离胶凝固后，将上层水倒掉，并用滤纸吸干；配制浓缩胶在不同的IOmL容量瓶中分别加入如表1所示质量的离子液体、486mg 丙烯酰胺、14mgN，N，-亚甲基双丙烯酰胺和151mg Tris-base，加水至大约8mL，用6mM的 HCl调pH值至6. 8，用水定容至IOmL ；混合均勻后，转移至离心管中，加入50 μ L当天配制的10%过硫酸铵和5 μ L的N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺，振荡混合20s，混合均勻后超声脱气10s，得到浓缩胶溶液，将浓缩胶溶液注入玻璃板，之后将梳子插入玻璃板中，直至凝胶凝固，将梳子拔出，形成进样孔，电泳用离子液体-聚丙烯酰胺凝胶制备完成。表1加入离子液体的质量
权利要求
1.一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，主要包括单体、交联剂、凝胶缓冲体系、催化剂和加速剂，其特征在于还包括离子液体；其中，所述离子液体为阳离子上烷基碳链碳原子数 (4的离子液体，所述离子液体的质量浓度为0. 05 1. 0% (w/v)。
2.根据权利要求1所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于所述阳离子上烷基碳链碳原子数< 4的离子液体为阳离子上烷基碳链碳原子数< 4的咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或吡咯烷类离子液体其中之一。
3.根据权利要求1所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于所述离子液体的质量浓度为0. 3 1. 0% (w/v)时用于分离分子量范围在26. 0 12. OKDa的蛋白质。
4.根据权利要求1所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于所述离子液体为阳离子上烷基碳链碳原子数< 4的吡啶类离子液体，质量浓度为1. 0% (w/v)。
5.一种如权利要求1 4所述的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，其特征在于 先将离子液体、单体、交联剂和凝胶缓冲体系混合得到混合溶液，再将催化剂和加速剂加入所述混合溶液混合均勻，凝固后，即可得到本发明所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶。
6.一种如权利要求1 4所述的离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的用途，其特征在于所述用途是将离子液体-聚丙烯酰胺凝胶用于电泳分析蛋白质，即离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述电泳方法步骤如下(1)制备一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶； O) SDS预处理蛋白质样品；(3)配制蛋白质电泳缓冲液并上样；(4)电泳；(5)染色和脱色；具体地说，所述电泳方法主要包括(1)制备离子液体-聚丙烯酰胺凝胶组装玻璃板制胶架，先将离子液体、单体、交联剂和凝胶缓冲体系混合得到混合溶液， 再将催化剂和加速剂加入所述混合溶液混合均勻后得离子液体-聚丙烯酰胺凝胶溶液，将所述凝胶溶液注入胶架的玻璃板中，之后将梳子插入玻璃板中的凝胶溶液中，直至凝胶凝固，将梳子拔出，形成进样孔；(2)预处理蛋白质样品在蛋白质样品中加入样品缓冲溶液，混合均勻后加热，然后冷却，得到预处理蛋白质样品 ；(3)配制蛋白质电泳缓冲液并上样组装电泳仪，配制蛋白质电泳缓冲液并加入电泳槽中；倒入蛋白质电泳缓冲液没过胶架玻璃板的短板，利用微量进样器将预处理后蛋白质样品注入孔道上样；(4)电泳接通电泳仪进行电泳；(5)染色和脱色电泳结束后，将凝胶从玻璃板上剥下，用水清洗，进行染色，染色完成后进行脱色处理， 直至去掉背景底色。
7.根据权利要求6所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的用途，其特征在于步骤(1)中组装制胶架时用凡士林密封制胶架玻璃板的两边和底部。
8.根据权利要求6所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的用途，其特征在于步骤(2)中蛋白质样品中加入样品缓冲溶液，混合均勻后，在95°C水浴加热5min，室温下冷却； 蛋白质样品的质量浓度为0. 1 0. 5mg/mL。
9.根据权利要求6所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的用途，其特征在于步骤(3)中蛋白质样品的上样体积为5 10μ L。
10.根据权利要求6所述的一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶的用途，其特征在于步骤 (5)中电泳结束后，在水中将凝胶从玻璃板上剥下。
全文摘要
本发明涉及一种离子液体-聚丙烯酰胺凝胶、其制法和用途，属于蛋白质分离分析技术领域。所述离子液体-聚丙烯酰胺凝胶包括单体、交联剂、凝胶缓冲体系、催化剂和加速剂，还包括离子液体；所述离子液体为阳离子上烷基碳链碳原子数≤4的离子液体，质量浓度为0.05～1.0％(w/v)。将离子液体、单体、交联剂和凝胶缓冲体系混合后再将催化剂和加速剂加入混合均匀，凝固后即可得到所述离子液体-聚丙烯酰胺凝胶。离子液体-聚丙烯酰胺凝胶用于电泳分离蛋白质，即离子液体-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经SDS处理后的蛋白质，尤其是对分子量相等或相近的不同蛋白质，可实现快速、简便、绿色且高效的分离。
文档编号C08F220/56GK102229688SQ20111009279
公开日2011年11月2日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者屈锋, 张涛, 盖青青 申请人:北京理工大学