一种氨基塑料基片及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：一种氨基塑料基片及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及氨基塑料基片及其制备方法与应用。
背景技术：
目前芯片技术已经成为生物学中进行大规模、高通量研究的一种至关重要的技术。随着生物芯片技术的发展，与其制备相关的材料技术、表面化学技术也需要不断得到改进和提高，这集中体现在不同材料的生物芯片基片的制备上。目前主要用刚性的无机材料-玻璃进行生物芯片基片的制备，但由玻璃制成的基片主要用于所有反应都是通过随机扩散的方式进行的被动式生物芯片的制备，而在能达到精确操作分子和细胞及控制反应目的的主动式芯片方面很少采用。相比塑料材质，玻璃材质不易加工成型，这使得其在以各种微结构为基础的微流控等生物芯片领域中尤为力不从心。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种生物芯片的基片及其制备方法。本发明所提供的制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤在塑料片基表面连接氨基，得到表面连接上氨基的基片。上述过程中所述连接的方法可为包括如下步骤的方法将所述塑料片基进行表面氧化改性，再与氨基硅烷化试剂发生硅烷化反应，使氨基硅烷化试剂与塑料片基间形成碳-氧-硅共价键而连接，得到表面连接上氨基的基片。为了便于表述，将此方法记作方法 I。上述方法I中，所述将所述塑料片基进行表面氧化改性，再与氨基硅烷化试剂发生硅烷化反应的方法可包括如下步骤将所述塑料片基表面氧化改性后，置于氨基硅烷化试剂的溶液中，进行硅烷化反应。上述任一所述方法I中，所述氨基硅烷化试剂的溶液中氨基硅烷化试剂的浓度可为0.01%-10% (体积百分含量)。上述任一所述方法I中，所述氨基硅烷化试剂可为(3-aminopropyl) triethoxysilane ( APTS)、(3-aminopropyl) diethoxymethylsilane ( APDMS)(3-aminopropyl) ethoxydimethylsilane ( APEMS)。上述任一所述方法I中，所述氨基硅烷化试剂的溶液中的溶剂可为水或乙醇。上述任一所述方法I中，所述将所述塑料片基进行表面氧化改性，再与氨基硅烷化试剂发生硅烷化反应的方法具体可为如下1)、2)或3)1)所述塑料片基为聚甲基丙烯酸甲酯片基、聚碳酸酯片基或聚苯乙烯片基，所述氨基硅烷化试剂溶液中的溶剂为水，所述硅烷化反应的温度为15°C -700C ；2)所述塑料片基为聚碳酸酯片基或聚苯乙烯片基，所述氨基硅烷化试剂溶液中的溶剂为乙醇，所述硅烷化反应的温度为15°C -70°C ；3)所述塑料片基为聚甲基丙烯酸甲酯片基，所述氨基硅烷化试剂溶液中的溶剂为乙醇，所述硅烷化反应的温度为15°C -30°C。通过上述任一所述方法I连接得到的基片是二维氨基塑料基片。上述过程中所述连接的方法可为包括如下步骤的方法将所述塑料片基进行表面氧化改性后，置于富含氨基的聚合物的溶液中，吸附，得到表面连接有氨基的基片。此方法实际是通过静电吸附实现的。为了便于表述，将此方法记作方法II。上述方法II中，所述吸附的温度可为10°C -50°C。上述任一所述方法II中，所述吸附的时间可为0. 5-30小时。上述任一所述方法II中，实际是通过富含氨基的聚合物分子与塑料片基表面的静电吸附作用实现的。在置于富含氨基的聚合物的溶液之前，先将塑料片基清洗干净，然后将塑料片基进行臭氧处理或通氧条件下Plasma处理以达到所需的亲水要求和表面氧化改性，处理时间随亲水要求变化而变化。上述过程中所述连接的方法还可为包括如下步骤的方法将所述塑料片基环氧基化，得到环氧基化的塑料片基；将所述环氧基化的塑料片基置于富含氨基的聚合物的溶液中，接枝反应，得到表面连接有氨基的基片。为了便于表述，将此方法记作方法III。上述方法III中，所述将所述塑料片基环氧基化的方法可包括如下步骤将所述塑料片基先进行表面氧化改性，然后置于环氧基硅烷化试剂的溶液中，环氧基化反应，得到所述环氧基化的塑料片基。上述任一所述方法III中，所述环氧基硅烷化试剂的溶液中的溶剂可为水或乙上述任一所述方法III中，所述环氧基硅烷化试剂的溶液中环氧基硅烷化试剂的浓度可为0.01%-10% (体积百分含量)。上述任一所述方法III中，所述环氧基化反应的时间可为0. 5-30小时。上述任一所述方法III中，所述将塑料片基环氧基化的方法具体可如下述1)、2) 或3)1)所述塑料片基为聚甲基丙烯酸甲酯片基、聚碳酸酯片基或聚苯乙烯片基，所述环氧基硅烷化试剂溶液中的溶剂为水，所述环氧基化反应的温度为15°C -70°C ；2)所述塑料片基为聚碳酸酯片基或聚苯乙烯片基，所述环氧基硅烷化试剂溶液中的溶剂为乙醇，所述环氧基化反应的温度为15°C -70°C ；3)所述塑料片基为聚甲基丙烯酸甲酯片基，所述环氧基硅烷化试剂溶液中的溶剂为乙醇，所述环氧基化反应的温度为15°C -30°C。上述任一所述方法III中，所述环氧基硅烷化试剂可为(3-Glycidyloxypropyl) trimethoxysilane ( ■禾尔 GPTMS)、(3-Glycidoxypropyl) dimethylethoxysilane (简称 GPDMES)或(3-Glycidoxypropyl) dimethoxymethylsilane ( GPDMMS)。上述任一所述方法III中，所述接枝反应的温度为10_50°C。
上述任一所述方法III中，所述接枝反应的时间为0. 5-30小时。上述任一所述方法II和方法III中，所述富含氨基的聚合物的溶液为水相。上述任一所述方法II和方法III中，所述富含氨基的聚合物的溶液中富含氨基的聚合物的浓度为0.0)0)1%-0.3% (质量百分含量)。上述任一所述方法II和方法III中，所述富含氨基的聚合物包括但不限于壳聚糖、多聚赖氨酸、聚亚乙基亚胺或聚烯丙基胺。上述任一所述方法中，当所述富含氨基的聚合物为壳聚糖时，所述壳聚糖的溶液是按照包括如下步骤的方法制得的先用醋酸溶解壳聚糖，得到壳聚糖溶液I，再用 0. IXPBS缓冲液稀释所述壳聚糖溶液I，得到所述壳聚糖的溶液；所述壳聚糖的溶液的PH 值为 5. 0-6.0。上述任一所述方法中，所述塑料片基包括但不限于聚碳酸酯片基、聚苯乙烯片基或聚甲基丙烯酸甲酯片基。上述任一所述方法I、方法II和方法III中，所述将塑料片基进行表面氧化改性的方法可包括如下步骤将所述塑料片基用臭氧处理或在通氧条件下将所述塑料片基 Plasma 处理。由上述任一所述方法制备得到的生物芯片基片也属于本发明的保护范围。由上述任一所述基片制得的生物芯片也属于本发明的保护范围。本发明的基片是一种氨基修饰的塑料基片，具体的说是先通过表面氧化改性处理，然后可以直接氨基硅烷化制得二维的氨基塑料基片，也可以通过静电吸附直接涂敷上富含氨基聚合物高分子从而形成三维氨基塑料基片，还可以选择不同的方法先在塑料片基上进行表面环氧基修饰(即制备环氧基塑料基片)，然后通过环氧基活性基团接枝上富含氨基的聚合物高分子，最终得到表面为高分子三维氨基塑料基片。后两种方法由于采用富含氨基的聚合物高分子，其较长的亲水连接臂有足够柔韧度，能够使固定于基片表面的样品分子同目标分子充分接触，较快实现分子之间的结合而平衡，从而提高基片的稳定性，同时固定灵敏度得到提高。实验证明，本发明氨基塑料基片说明塑料材质的表面可以进行很好的氨基修饰(甚至可以由氨基延伸的醛基修饰等)和环氧基修饰，进而制成氨基塑料基片，实现了在塑料材料上制备性能优良的生物芯片。由于塑料的可塑性强，易于成型加工， 可以制备出各种微结构、各种功能单元，因此本发明基片在微流控等生物芯片领域中将有广阔的应用前景。


图1核酸芯片点阵设计图.图2普通氨基基片点制Oligo的芯片杂交效果图。图3是通过氨基硅烷化制备的二维氨基塑料基片(实施例3制备的基片)上点制 Oligo的芯片杂交效果图。图4是通过直接涂敷制备的三维氨基塑料基片(实施例12制备的基片)上点制 Oligo的芯片杂交效果图。图5是通过共价结合制备的三维氨基塑料基片(实施例15制备的基片)上点制 Oligo的芯片杂交效果图。
图6是通过共价结合制备的三维氨基塑料基片(实施例16制备的基片)上点制 Oligo的芯片杂交效果图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。壳聚糖(chitosan)、多聚赖氨酸(polylysine)、聚亚乙基亚胺 (polyethyleneimine)、聚烯丙基胺(polyallylamine)均购自 Sigma。(3-Glycidyloxypropyl) trimethoxysilane ( GPTMS)、；(3-Glycidoxypropyl) dimethylethoxysilane (简称 GPDMES)、(3-Glycidoxypropyl) dimethoxymethylsilane ( GPDMMS)、(3-aminopropyl) triethoxysilane ( APTS)、(3-aminopropyl) diethoxymethylsilane ( APDMS) \)J,R(3-aminopropyl) ethoxydimethylsilane ( APEMS) _ 自 Sigma。聚碳酸酯片基(简称PC片基)，它的材质为聚碳酸酯(Polycarbonate)；聚苯乙烯片基(简称PS片基)，它的材质为聚苯乙烯(Polystyrene)，聚苯乙烯是指由苯乙烯单体经自由基缩聚反应合成的聚合物；聚甲基丙烯酸甲酯片基(简称PMMA片基)，它的材质是聚甲基丙烯酸甲酯 (Polymethylmethacrylate) 0以上PC片基、PS片基以及PMMA片基均购自北京市东珠有机玻璃经营部，尺寸均为(75. 5mm士 0. 2mm) X (25. 2mm士 0. 2mm) X (1. 0mm)。下述实施例中的壳聚糖溶液均是按照如下方法制得的先用(体积百分比) 醋酸溶解壳聚糖，得到浓溶液，然后用0. IXPBS缓冲液稀释所述浓溶液，得到壳聚糖溶液， 且调节壳聚糖溶液的PH值至5. 0-6. 0。实施例1、在水溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1、片基的预处理将塑料片基PS去离子水清洗、甩干，进行O3处理池或通氧条件下 Plasma 处理 2min。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APTS的水溶液中，APTS在溶液中的浓度为0. 01 % (体积百分含量)，在70°C、120rpm摇动条件下反应30小时；用去离
子水清洗、甩干即得二维氨基塑料基片。塑料片基经过表面清洗和表面改性，通过与APTS反应从而使塑料片基表面为氨基分布，制得氨基塑料基片(二维氨基塑料基片)。将塑料片基PS换成PC或PMMA，进行上述实验，也得到了二维氨基塑料基片。实施例2、在水溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1、片基的预处理同实施例1中实验1。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APTS的水溶液中，APTS在溶液中的浓度为10% (体积百分含量)，在15°C、120rpm摇动条件下反应0. 5小时；用去离子
水清洗、甩干即得二维氨基塑料基片。
将塑料片基PS换成PC或PMMA，进行上述实验，也得到了二维氨基塑料基片。实施例3、在水溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1、片基的预处理同实施例1中实验1。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APTS的水溶液中，APTS在溶液中的浓度为0. 5% (体积百分含量)，在35°C、120rpm摇动条件下反应5小时；用去离子水清洗、甩干即得二维氨基塑料基片。将塑料片基PS换成PC或PMMA，进行上述实验，也得到了二维氨基塑料基片。实施例4、在乙醇溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1.片基的预处理将塑料片基PC去离子水清洗、甩干，进行O3处理证或通氧条件下 Plasma 处理 3min。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APDMS的乙醇溶液中，APDMS 在溶液中的浓度为10% (体积百分含量)，在15°C、120rpm摇动条件下反应0. 3小时；用乙醇清洗、甩干即得氨基塑料基片(二维氨基塑料基片)。将塑料基片PC换成PS，进行上述实验，也得到了二维氨基塑料基片。实施例5、在乙醇溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1.片基的预处理同实施例4中实验1。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APDMS的乙醇溶液中，APDMS 在溶液中的浓度为0. 01 % (体积百分含量)，在70°C、120rpm摇动条件下反应30小时；用乙醇清洗、甩干即得氨基塑料基片(二维氨基塑料基片)。将塑料基片PC换成PS，进行上述实验，也得到了二维氨基塑料基片。实施例6、在乙醇溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1.片基的预处理同实施例4中实验1。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APDMS的乙醇溶液中，APDMS 在溶液中的浓度为0. 5% (体积百分含量)，在45°C、120rpm摇动条件下反应5小时；用乙醇清洗、甩干即得氨基塑料基片(二维氨基塑料基片)。将塑料基片PC换成PS，进行上述实验，也得到了二维氨基塑料基片。实施例7、在乙醇溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1、片基的预处理将塑料片基PMMA去离子水清洗、甩干，进行O3处理池或通氧条件下Plasma处理Imin02、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APEMS的乙醇溶液中，APEMS 在溶液中的浓度为0.5% (体积百分含量)，在20°C、120rpm摇动条件下反应15小时；用乙醇清洗、甩干即得氨基塑料基片(二维氨基塑料基片)。实施例8、在乙醇溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1、片基的预处理同实施例7中实验1。用塑料片基PMMA进行实验。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APEMS的乙醇溶液中，APEMS在溶液中的浓度为10% (体积百分含量)，在30°C、120rpm摇动条件下反应0. 5小时；用乙醇清洗、甩干即得氨基塑料基片(二维氨基塑料基片)。实施例9、在乙醇溶液中用氨基硅烷化方法制备二维氨基塑料基片1、片基的预处理同实施例7中实验1。用塑料片基PMMA进行实验。2、氨基硅烷化将步骤1预处理后的塑料片基，置于APEMS的乙醇溶液中，APEMS 在溶液中的浓度为0.01% (体积百分含量)，在15°C、120rpm摇动条件下反应30小时；用
乙醇清洗、甩干即得氨基塑料基片(二维氨基塑料基片)。实验表明，PMMA片基在乙醇相中，温度较高(如45°C、50°C、70°C )的条件下会出现溶胀现象，进而导致塑料片基变形，得不到合格的二维氨基塑料基片。实施例10、在塑料片基上直接涂敷富含氨基的聚合物高分子，制备表面三维氨基塑料基片1、塑料片基的清洗和表面氧化改性将塑料片基PMMA用去离子水清洗干净后，用臭氧处理池或用通氧条件下Plasma 处理2min ；2、涂敷富含氨基的聚合物高分子壳聚糖(chitosan)溶液为终浓度为0.001% (质量百分含量)的壳聚糖的 0. IXPBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为 6. 0。将步骤1得到的表面改性塑料片基浸入壳聚糖(chitosan)溶液中，在50°C、以 120rpm的速度摇动的条件下反应0. 5小时；停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。
得到表面三维氨基塑料基片。将塑料片基PMMA替换为PC或PS，再将chitosan分别替换为富含氨基的聚合物 polylysine、polyethyIeneimine或polyallylamine进行上述实验，不同的是这三禾中聚合物的溶液为水溶液，结果均得到了三维氨基塑料基片。塑料片通过表面清洗和表面氧化改性后，与富含氨基的聚合物高分子上的部分氨基发生静电吸附作用从而使塑料片基表面吸附上富含氨基聚合物高分子，每个富含氨基聚合物分子上剩下的氨基使塑料片基表面形成三维的氨基，即表面三维氨基分布的氨基塑料基片(三维氨基塑料基片)。实施例11、在塑料片基上直接涂敷富含氨基的聚合物高分子，制备表面三维氨基塑料基片1、塑料片基的清洗和表面氧化改性同实施例10中实验1。2、涂敷富含氨基的聚合物高分子壳聚糖(chitosan)溶液为终浓度为0. 3% (质量百分含量)的壳聚糖的0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的pH值调至为5. 0。将步骤1得到的表面改性塑料片基浸入壳聚糖(chitosan)溶液中，在10°C、以 120rpm的速度摇动的条件下反应30小时；停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。得到表面三维氨基塑料基片。
将塑料片基PMMA替换为PC或PS，再将chitosan分别替换为富含氨基的聚合物 polylysine、polyethyIeneimine或polyallylamine进行上述实验，不同的是这三禾中聚合物的溶液为水溶液，结果均得到了三维氨基塑料基片。实施例12、在塑料片基上直接涂敷富含氨基的聚合物高分子，制备表面三维氨基塑料基片1、塑料片基的清洗和表面氧化改性同实施例10中实验1。2、涂敷富含氨基的聚合物高分子壳聚糖(chitosan)溶液为终浓度为0. 06% (质量百分含量)的壳聚糖的0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为5. 5。将步骤1得到的表面改性塑料片基浸入壳聚糖(chitosan)溶液中，在25°C、以 120rpm的速度摇动的条件下反应15小时；停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。得到表面三维氨基塑料基片。将塑料片基PMMA替换为PC或PS，再将chitosan分别替换为富含氨基的聚合物 polylysine、polyethyIeneimine或polyallylamine进行上述实验，不同的是这三禾中聚合物的溶液为水溶液，结果均得到了三维氨基塑料基片。实施例13、在水溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三维氨基塑料基片1、片基的预处理将塑料片基PC进行臭氧处理或Plasma处理，具体方法为将塑料片基清洗、甩干后，进行表面臭氧处理釙或通氧条件下Plasma处理;3min。2、环氧基化，也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPTMS的水溶液中，GPTMS在溶液中的浓度为 0.01% (体积百分含量)，在70°C、300rpm摇动条件下反应0. 5小时；用去离子水清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子polyallylamine 溶液为终浓度为 0. 001% (质量百分含量)的 polyallylamine 的水溶液，所述终浓度为polyallylamine在polyallylamine溶液中的浓度。将步骤2得到的环氧基化的塑料片基也即环氧塑料基片浸入polyallylamine溶液中，在50°C、以120rpm的速度摇动的条件下反应0. 5小时。停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。得到三维氨基塑料基片(三维氨基塑料基片)。将塑料片基PC替换为PS或PMMA，再将富含氨基的聚合物polyallylamine替换为 chitosan、polylysine或polyethyleneimine进行上述实验，也均得到了三维氨基塑料基片。不同的是，壳聚糖(chitosan)溶液为终浓度为0.001% (质量百分含量)的壳聚糖的 0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为 6. 0。实施例14、在水溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三
维氨基塑料基片
1、片基的预处理同实施例13中实验1。2、环氧基化，也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPTMS的水溶液中，GPTMS在溶液中的浓度为 10% (体积百分含量)，在15°c、300rpm摇动条件下反应30小时；用去离子水清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子polyallylamine溶液为终浓度为0. 3% (质量百分含量)Wpolyallylamine的水溶液，所述终浓度为polyallylamine在polyallylamine溶液中的浓度。将步骤2得到的环氧基化的塑料片基也即环氧塑料基片浸入polyallylamine溶液中，在10°c、以120rpm的速度摇动的条件下反应30小时。停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。得到表面三维氨基的氨基塑料基片 (三维氨基塑料基片)。将塑料片基PC替换为PS或PMMA，再将富含氨基的聚合物polyallylamine替换为chitosan、polylysine或polyethyleneimine进行上述实验，也均得到了三维氨基塑料基片。不同的是，壳聚糖(chitosan)溶液为终浓度为0.3% (质量百分含量)的壳聚糖的 0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为 5. 0。实施例15、在水溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三维氨基塑料基片1、片基的预处理同实施例13中实验1。2、环氧基化，也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPTMS的水溶液中，GPTMS在溶液中的浓度为 0.5% (体积百分含量)，在35°C、300rpm摇动条件下反应15小时；用去离子水清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子polyallylamine溶液为终浓度为0. 06% (质量百分含量)的polyallylamine 的水溶液，所述终浓度为polyallylamine在polyallylamine溶液中的浓度。将步骤2得到的环氧基化的塑料片基也即环氧塑料基片浸入polyallylamine溶液中，在25°C、以120rpm的速度摇动的条件下反应15小时。停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。得到表面为三维氨基的氨基塑料基片(三维氨基塑料基片)。将塑料片基PC替换为PS或PMMA，再将富含氨基的聚合物polyallylamine替换为chitosan、polylysine或polyethyleneimine进行上述实验，也均得到了三维氨基塑料基片。不同的是，壳聚糖(chitosan)溶液为终浓度为0.06% (质量百分含量)的壳聚糖的 0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为 5 · 5 ο实施例16、在乙醇溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三维氨基塑料基片1、塑料片基的预处理
同实施例13中实验1。2、塑料片基PC环氧基化也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPDMES的乙醇溶液中，GPDMES在溶液中的浓度为10% (体积百分含量)，在15°C、150rpm 摇动条件下反应0. 5小时；用乙醇清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子壳聚糖(chitosan)溶液为终浓度为0. 08% (质量百分含量)的壳聚糖的0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为6. 0。将步骤2得到的环氧基化的塑料片基浸入壳聚糖(chitosan)溶液中，在25°C、以 120rpm的速度摇动的条件下反应3小时；停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。得到表面三维氨基塑料基片。将塑料片基PC替换为PS，再将富含氨基的聚合物chitosan替换为polylysine、 polyallylamine或polyethyleneimine进行上述实验，不同的是这三种聚合物的溶液为水溶液，结果也均得到了三维氨基塑料基片。实施例17、在乙醇溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三维氨基塑料基片1、塑料片基的预处理同实施例13中实验1。2、塑料片基PC环氧基化也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPDMES的乙醇溶液中，GPDMES在溶液中的浓度为0. 01% (体积百分含量)，在70°C、 150rpm摇动条件下反应0. 5小时；用乙醇清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子同实施例16中的实验3。清洗、甩干，即得三维氨基塑料基片。将塑料片基PC替换为PS，再将富含氨基的聚合物chitosan替换为polylysine、 polyallylamine或polyethyleneimine进行上述实验，不同的是这三种聚合物的溶液为水溶液，结果也均得到了三维氨基塑料基片。实施例18、在乙醇溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三维氨基塑料基片1、塑料片基的预处理同实施例13中实验1。2、塑料片基PC环氧基化也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPDMES的乙醇溶液中，GPDMES在溶液中的浓度为0. 5% (体积百分含量)，在50°C、 150rpm摇动条件下反应3小时；用乙醇清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子同实施例16中的实验3。清洗、甩干，即得三维氨基塑料基片。将塑料片基PC替换为PS，再将富含氨基的聚合物chitosan替换为polylysine、 polyallylamine或polyethyleneimine进行上述实验，不同的是这三种聚合物的溶液为水溶液，结果也均得到了三维氨基塑料基片。
实施例19、在乙醇溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三维氨基塑料基片1、塑料片基的预处理用塑料片基PMMA进行实验。处理方法同实施例13中实验1。2、塑料PMMA片基环氧基化也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPDMMS的乙醇溶液中，GPDMMS在溶液中的浓度为10% (体积百分含量)，在15°C、 150rpm摇动条件下反应30小时；用乙醇清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子polylysine溶液为终浓度为0.08% (质量百分含量)的polylysine的水溶液， 所述终浓度为polylysine在polylysine溶液中的浓度。将步骤2得到的环氧基化的塑料片基浸入polylysine溶液中，在25°C、以120rpm 的速度摇动的条件下反应30小时；停止反应，将塑料片基用去离子水洗涤、甩干。得到表面三维氨基塑料PMMA基片。将富含氨基的聚合物polylysine替换为chitosan、polyallylamine或 polyethyleneimine进行上述实验，也均得到了三维氨基塑料PMMA基片。不同的是，壳聚糖 (chitosan)溶液为终浓度为0.08% (质量百分含量)的壳聚糖的0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为6. 0。实施例20、在乙醇溶液中用化学方法制备环氧基化的塑料片基，再用此片基制备三维氨基塑料基片1、塑料片基的预处理用塑料片基PMMA进行实验。处理方法同实施例13中实验1。2、塑料PMMA片基环氧基化也即制备环氧塑料基片将步骤1预处理后的塑料片基置于GPDMMS的乙醇溶液中，GPDMMS在溶液中的浓度为0. 01% (体积百分含量)，在30°C、 150rpm摇动条件下反应0. 5小时；用乙醇清洗、甩干；3、接枝富含氨基的聚合物高分子同实施例19中的实验3。清洗、甩干，即得三维氨基塑料PMMA基片。将富含氨基的聚合物polylysine替换为chitosan、polyallylamine或 polyethyleneimine进行上述实验，也均得到了三维氨基塑料PMMA基片。不同的是，壳聚糖 (chitosan)溶液为终浓度为0.08% (质量百分含量)的壳聚糖的0. IX PBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度；壳聚糖溶液的PH值调至为5. 5。实验表明，PMMA片基在乙醇相中，温度较高时如45°C、50°C、70°C的条件下会出现溶胀现象，进而导致塑料片基变形，得不到合格的三维氨基塑料基片。由实施例1-9制得的氨基塑料基片表面分子结构类似，基片每个点上去是一个氨基的氨基塑料基片，整个片基修饰为二维氨基塑料基片；由实施例10-20制得的基片的表面分子结构类似，基片每个点上去是一条含有几个、几十个或更多氨基的长链聚合物，所以整个片基表面形成一种高分子聚合物三维氨基分布的三维氨基塑料基片。实施例21、普通氨基基片和氨基塑料基片应用于核酸芯片的制备本实施例所用的普通氨基基片为目前常用的玻片氨基硅烷化方法制得，即在玻片上先进行氨基硅烷化后再烘烤交联，即得普通氨基玻璃基片。本实施例所用的氨基塑料基片是分别由实施例1-20中方法得到的。生物芯片的制备过程如下1.将 3 种不同浓度的!35mer Oligo 样品(其序列为(T) 15_TCGGATTCGACAACACCCGT， 含50% DMS0)溶液，每种样品取出IOuL转移加入384孔板中；配制50% DMSO溶液作为空白(BC)对照，也取出IOuL转移加入384孔板中；QC(点样的阳性质控，其序列为(T)15-GTG CAA CTC ACT CGA CTG-3，HEX，含 50% DMS0)是两种浓度(luM，2. 5uM)的一端带有 HEX 标记的同一种寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，各取出IOuL转移加入384孔板中。2.通过自动点样装置将准备好的点样样品分别点到普通氨基玻璃基片和由实施例3、12、15、16制备的氨基塑料基片表面上。具体点阵方式如图1所示每张芯片包括4 个点阵，每个点阵包含36个点，每个点阵的点阵设计为6行*6列，样品重复形式为1*6，点间距为400um，6个样品在芯片点阵上的位置从上至下依次为luM QC、2. 5uM QC、BC、2. 5uM Oligo 样品、5. OuM Oligo 样品、IOuM Oligo 样品。3.将点样后的芯片37°C湿盒过夜固定；4.向每个芯片点阵上加入含有荧光HEX修饰的Arab-HEX (其序列为HEX-5，-ACTG GACTTGACGGGTGTTGTCGAATCCGA)的芯片杂交液，在100%湿度下，于42°C下杂交12-16小时； 杂交液0. 1% SDS、3XSSC、25% 甲酰胺、5XDenhardt，s。5.反应后芯片分别在两种洗液中42°C各洗anin，洗液I :0. 3XSSC/0. 1% SDS，洗 Mil :0. 06 X SSC0最后，玻片离心甩干。6.芯片扫描和数据处理。数据分析使用晶芯 LUXSCan-10K/B(博奥生物有限公司)扫描杂交后的芯片，扫描参数均设定Laser/PMT = 90/700。普通氨基玻璃基片与由实施例3、12、15、16制备的氨基塑料基片的扫描图像分别如图2、3、4、5、6所示。实施例1、2、4-9制得的二维塑料基片具有与实施例3相似效果，实施例10和11制得的三维塑料基片具有与实施例12相似效果，实施例13、14、17-20制得的三维塑料基片具有与实施例15或16类似效果。图3是实施例3中基片的结果((a) 二维氨基PS基片，(b) 二维氨基PC基片，(c) 二维氨基PMMA基片)；图4是实施例12中基片的结果((a)直接涂敷Chitosan的三维氨基PMMA基片， (b)直接涂敷Polylysine的三维氨基PS基片，(c)直接涂敷Polyallylamine的三维氨基 PS基片，(d)直接涂敷Chitosan的三维氨基PC基片，(e)直接涂敷Chitosan的三维氨基 PS基片)。图5是实施例15中基片的结果((a)共价结合Chitosan的三维氨基PMMA基片， (b)共价结合Polylysine的三维氨基PS基片，(c)共价结合Polyallylamine的三维氨基 PS基片)。图6是实施例16中基片的结果((a)共价结合Chitosan的三维氨基PS基片，(b) 共价结合Polylysine的三维氨基PS基片，(c)共价结合Polyallylamine的三维氨基PS基片，(d)共价结合Chitosan的三维氨基PC基片)。结果表明，与普通氨基玻璃基片相比，本发明由塑料片基制备的氨基塑料基片的对于3种不同浓度的核酸样品固定信号强度与普通氨基玻璃基片的效果无显著差异，表明本发明基片可以用于制备芯片。考虑到塑料材料的易于成型加工的特点，本发明的以塑料为材料的氨基基片能够用于微流控等生物芯片领域中。
权利要求
1.一种制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤在塑料片基表面连接氨基，得到表面连接上氨基的基片；所述连接的方法包括如下步骤将所述塑料片基环氧基化，得到环氧基化的塑料片基； 将所述环氧基化的塑料片基置于富含氨基的聚合物的溶液中，接枝反应，得到所述表面连接有氨基的基片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述将塑料片基环氧基化的方法包括如下步骤将所述塑料片基先进行表面氧化改性，然后置于环氧基硅烷化试剂的溶液中，环氧基化反应，得到所述环氧基化的塑料片基。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述环氧基硅烷化试剂的溶液中的溶剂为水或乙醇。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述环氧基硅烷化试剂的溶液中环氧基硅烷化试剂的浓度为0. 01% -10% (体积百分含量)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述环氧基化反应的时间为0.5-30小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述将塑料片基环氧基化的方法如下述 1)、2)或 3)1)所述塑料片基为聚甲基丙烯酸甲酯片基、聚碳酸酯片基或聚苯乙烯片基，所述环氧基硅烷化试剂溶液中的溶剂为水，所述环氧基化反应的温度为15°C -70°C ；2)所述塑料片基为聚碳酸酯片基或聚苯乙烯片基，所述环氧基硅烷化试剂溶液中的溶剂为乙醇，所述环氧基化反应的温度为15°C -70°C ；3)所述塑料片基为聚甲基丙烯酸甲酯片基，所述环氧基硅烷化试剂溶液中的溶剂为乙醇，所述环氧基化反应的温度为15°C -30°C。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述环氧基硅烷化试剂为(3-GlycidyIoxypropy1)trimethoxysilane、(3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysi lane 或(3-Glycidoxypropyl)dimethoxymethylsi Iane0
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述接枝反应的温度为10-50°C。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述接枝反应的时间为0.5-30小时。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚合物的溶液为水相。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚合物的溶液中富含氨基的聚合物的浓度为0.001% -0.3% (质量百分含量)。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚合物为壳聚糖、多聚赖氨酸、聚亚乙基亚胺或聚烯丙基胺。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述壳聚糖的溶液是按照包括如下步骤的方法制得的先用醋酸溶解壳聚糖，得到壳聚糖溶液I，再用0. IXPBS缓冲液稀释所述壳聚糖溶液I，得到所述壳聚糖的溶液；所述壳聚糖的溶液的PH值为5. 0-6. 0。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述将塑料片基进行表面氧化改性的方法包括如下步骤将所述塑料片基用臭氧处理或在通氧条件下将所述塑料片基Plasma处理。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述塑料片基为聚碳酸酯片基、聚苯乙烯片基或聚甲基丙烯酸甲酯片基。
16.由权利要求1-15中任一所述方法制备得到的生物芯片基片。
17.由权利要求16所述基片得到的生物芯片。
全文摘要
本发明公开了氨基塑料基片及其制备方法与应用。该制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤在塑料片基表面连接氨基，得到表面连接上氨基的基片。实验证明，本发明实现了在塑料材料上制备性能优良的生物芯片。由于塑料的可塑性强，便于成型加工，设计各种微结构、功能单元，因此可应用于微流控等生物芯片领域中。
文档编号C08L69/00GK102276863SQ20111015377
公开日2011年12月14日 申请日期2009年9月1日 优先权日2009年9月1日
发明者吕品, 周玉祥, 王佳, 王素珍, 甘五鹏, 程京 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学