专利名称：一种超低分子肝素钠的制备方法
技术领域：
本发明属 于生物医药领域,具体涉及一种超低分子肝素钠(Ultra LowMolecularWeight Heparin, ULMWH)的制备方法。
背景技术：
低分子肝素是从普通肝素通过降解得到的小分子肝素制品，具有生物利用率高、血浆半衰期长等优点，特别是其引起的出血副作用大幅降低。从普通肝素到低分子肝素的降解方法较多，目前采用的降解方法主要有亚硝酸降解、β_消除降解法、过氧化物降解法以及肝素酶降解。超低分子肝素是在低分子肝素基础上进一步纯化分离得到的肝素衍生品，其平均分子量小于3000Da。与低分子肝素相比，超低分子肝素具抗凝作用安全，其抗血栓作用强，皮下注射易吸收，主要用于血栓栓塞性疾病的预防，如肾病综合症，手术后静脉血栓的形成、老年静脉血栓和心脑血管疾病的预防以及防治高血脂症等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超低分子肝素钠的制备方法，该制备方法降解条件温和可减少磺酸基从肝素上的脱落，通过该方法制备的超低分子肝素钠平均分子量小于3000Da，具有高抗Fxa生物活性。本发明所采用的技术方案如下一种超低分子肝素钠的制备方法，包括如下步骤(I)取精品肝素配成10%的水溶液，室温下边搅拌边加入季铵盐如苄索氯铵，I 2小时后停止搅拌，沉降、倾倒、洗涤沉淀物，最后过滤、干燥，得到白色肝素季铵盐固体；(2)将⑴中的肝素季铵盐固体溶解于有机溶剂中配成5% 10%的溶液，加入与肝素季铵盐等量的氯化苄，30°C 35°C下，搅拌反应24小时后，冷至室温，加入2倍体积的10%醋酸钠/甲醇溶液，搅拌30分钟后，静止沉淀，过滤，甲醇洗涤，室温下真空干燥，得到肝素的酯化物；(3)将(2)得到的肝素酯化物溶于10倍的水中配成溶液，将2. 3 2. 5倍的酯化物量的苄索氯铵溶于10倍的水中，完全溶解后，室温、剧烈搅拌下将此溶液慢慢加入到肝素酯化物的水溶液中；添加完成后，继续搅拌1-2小时，然后停止搅拌；待白色固体沉降后，倾去上层清夜，加水洗涤，过滤，再洗涤，然后真空下干燥(不高于50°C )，得到肝素酯化物的季铵盐；(4)将(3)得到的肝素酯化物的季铵盐溶于10倍的有机溶剂中，待溶解后，加入O. 05 O. 2摩尔浓度的碱如苄基三甲基氢氧化铵、DBU(二氮杂二环)、或甲醇钠，在温度为(TC 50°C (优选10°C 40)下反应4 24小时(优选8 12小时)进行β -消除降解；(5)将(4)反应结束后的降解物，在室温下加入两倍体积的10%的醋酸钠的甲醇溶液，搅拌I 2小时后，在O °C 4°C下沉降、过滤、甲醇洗涤，在25 °C 35 °C下真空干燥，得到低分子肝素钠的粗品；(6)上述(5)中的低分子肝素钠粗品配成10%的溶液，(TC 4°C下加入氢氧化钠溶液，调pH在9 10，并在此温度下反应3小时；而后用IM盐酸中和，加入氯化钠至盐度为8 10%，用3倍的甲醇沉淀，沉淀物用甲醇洗涤，真空干燥；(7)上述(6)中的低分子肝素钠粗品配成10%的溶液，IM氢氧化钠溶液，调pH值为9 10，加入30%的过氧化氢搅拌6小时后，滴加IM的盐酸至中性，然后加入8 10%的氯化钠，再用2. 5 3倍的甲醇沉淀低分子肝素钠；过滤，用甲醇洗涤后干燥制得低分子肝素钠的精品；(8)上述(7)中得到的精品低分子肝素通过含ATIII填料柱，以O. 15M的氯化钠/0. 05M Tris (三羟甲基氨基甲烷)溶液(pH = 7.4)为淋洗剂，洗去杂质和活性低的分子，然后以I. OM的氯化钠/0. 05M Tris溶液(pH = 7. 4)溶液为洗脱剂，将超低分子肝素从柱 子上洗脱，得到的洗脱液用3倍的甲醇沉淀，过滤，甲醇洗涤，真空干燥；(9)将上述(8)得到的产物溶于水配成10%的溶液后，添加氯化钠至浓度为10%，用3倍体积的甲醇沉淀，过滤，甲醇洗涤，真空干燥得到超低分子肝素钠精品；(10)将上述(9)得到的精品超低分子肝素钠溶解于去离子水配成10%的溶液，用O. 2微米的膜过滤后，冷冻干燥，最终得到超低分子肝素钠，其抗FXa效价在160 220IU/mg，抗FIIa效价在O. 5 4IU/mg，平均分子量在2000 3000Da。作为本发明进一步的改进，上述超低分子肝素钠制备方法中步骤(4)所述有机溶剂为二氯甲烷或二甲基甲酰胺。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为I、本发明提供的制备方法是将普通肝素在有机溶剂中进行β -消除降解，减少了磺酸基从肝素上脱落，制备方法可行且降解条件温和，因而保证了最终产物的抗凝活性。2、本发明将低分子肝素钠经过含ATIII填料柱进行高选择性分离、纯化得到抗凝活性更高的超低分子肝素钠，按照本方法制备的超低分子肝素钠的抗FXa效价在160 220IU/mg、抗FIIa效价在O. 5 4IU/mg，平均分子量在2000 3000Da。
具体实施例方式实施例I取100克的精品肝素钠溶解于I升水，然后在快速搅拌下加入含270克苄索氯铵的水溶液600毫升，反应2小时后，加入2升水，静止沉降，倾倒去上部清夜，再加水洗涤,然后过滤，水洗涤，干燥，约得到270克的肝素季铵盐；取上述反应得到的肝素季铵盐100克溶解于500毫升的二氯甲烷中，室温下加入100毫升的氯化苄，在30°C下反应24小时后，加入I. 2升的10%醋酸钠甲醇溶液，搅拌20分钟后，沉降、过滤、甲醇洗涤、干燥，得到肝素酯化物44克；将10克肝素酯化物溶于200毫升水中配成溶液，室温、快速搅拌下加入含23克苄索氯铵的100毫升的水溶液，反应2小时后，沉降，用水洗涤，50°C下真空干燥，得到22克肝素酯化物的季铵盐；将10克肝素酯化物的季铵盐溶于100毫升二氯甲烷中，室温下加入17毫升的苄基三甲基氢氧化铵并搅拌反应24小时。反应结束后，加入200毫升的10%醋酸钠甲醇溶液，继续搅拌I小时，静止沉降，过滤，甲醇洗涤，室温真空干燥，得到3. 6克低分子肝素粗品；将得到的粗品低分子肝素钠3克溶于30毫升水，(TC下加入IM的氢氧化钠调pH到9. 5,反应3 4小时后,加入30%的过氧化氢至浓度为O. 05%,室温下搅拌6小时后，用IM的盐酸调溶液到中性，加入氯化钠，使得氯化钠的浓度为8%，用100毫升的甲醇沉淀。过滤，甲醇洗涤，45°C下真空干燥，得到精制产品2. 6克；将精品低分子肝素钠I克溶于10毫升O. 15M氯化钠/0. 05M Tris (三羟甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；缓血酸胺)溶液(pH = 7. 4)，上含ATIII (抗凝血酶III)填料柱(600X IOmm)，以 200 毫升 O. 15M 氯化钠 /0. 05M Tris 溶液(pH = 7. 4)淋洗后，I. OM 氯化钠/0. 05M Tris溶液(pH = 7. 4)洗脱，洗脱液用3倍甲醇沉淀，过滤，甲醇洗涤，室温下真空干燥，得到O. 8克超低分子肝素钠；将O. 8克超低分子肝素钠溶于去离子水配成10%溶液，用O. 2微米的膜过滤，冷冻 干燥，最终得到精品超低分子肝素钠。上述超低分子肝素钠的平均分子量为2400Da，抗FXa (抗凝血因子a)值为193IU/mg,抗FIIa(凝血酶)值为I. 2IU/mg。实施例2含ATIII填料的制备将10克溴化氰溶于100毫升去离子水成溶液，在室温下加入150毫升琼脂糖浆，冰浴下用氢氧化钠调pH到11. 5，继续搅拌10分钟后，水洗；700毫克ATIII (抗凝血酶III)溶于200毫升O. 2M的碳酸氢钠溶液，而后加入到上面制备的凝胶中，室温下搅拌24小时后，用pH7 9和pH4 6的缓冲溶液洗涤，得到含ATIII的目标填料。
权利要求
1.一种超低分子肝素钠的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)取精品肝素的水溶液，加入季铵盐，得到白色肝素季铵盐固体； (2)上述(I)中的肝素季铵盐固体溶解于有机溶剂中，加入氯化苄得到肝素酯化物； (3)上述(2)中的肝素酯化物溶于水，加入季铵盐，得到白色肝素酯化物季铵盐固体； (4)上述(3)中的肝素酯化物的季铵盐溶于有机溶剂中，在有机碱作用下进行β_消除降解； (5)上述(4)中的降解物在氢氧化钠作用下转化为钠盐，得到超低分子肝素钠的粗品； (6)上述(5)中超低分子肝素钠粗品通过氧化脱色精制、得到超低分子肝素钠； (7)上述￠)中的低分子肝素钠通过含ATIII填料柱分离，得到高活性超低分子肝素钠； (8)上述(7)中得到的超低分子肝素钠经精密过滤，冷冻干燥得到医用超低分子肝素原料药。
2.按照权利要求I所述一种超低分子肝素钠的制备方法，其特征在于制备步骤(I)中所述季铵盐为苄索氯铵。
3.按照权利要求I所述一种超低分子肝素钠的制备方法，其特征在于制备步骤(4)中所述有机溶剂为二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
4.按照权利要求I所述一种超低分子肝素钠的制备方法，其特征在于制备步骤(4)中所述有机碱为苄基三甲基氢氧化铵等季銨碱、DBU或醇钠。
5.按照权利要求I所述一种超低分子肝素钠的制备方法，其特征在于按照本制备方法制得的超低分子肝素钠为抗FXa效价在160 220IU/mg，抗FIIa效价在O. 5 4IU/mg，平均分子量在2000 3000Da。
全文摘要
本发明提供了一种超低分子肝素钠的制备方法，该方法将普通肝素在有机溶剂中进行β-消除降解后得到低分子肝素钠，再经过含ATIII填料柱分离得到高抗FXa活性的超低分子肝素钠的制备方法。本发明提供的制备方法可行且降解条件温和，保证了最终产物的抗凝活性。按照本方法制备的超低分子肝素钠的抗FXa效价在160～220IU/mg、抗FIIa效价在0.5～4IU/mg，平均分子量在2000-3000Da。
文档编号C08B37/10GK102816255SQ201110155159
公开日2012年12月12日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者王芃 申请人:王芃