专利名称：一种细胞培养支架材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程支架材料，尤其涉及一种用于肿瘤细胞体外三维培养的具有微米孔道的细菌纤维素/胶原支架材料及其制备方法。
背景技术：
癌症是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。癌症与心脑血管疾病和意外事故一起，构成当今世界所有国家三大死亡原因。世界卫生组织(WHO)和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。在抗癌药发展应用的初期，对抗癌药功效的检测通常采用体外细胞培养板中二维培养病变组织细胞和动物实验。由于人体组织中，细胞生长的微环境是在三维的条件下，而且三维的立体环境对肿瘤组织的调节和恶化都有很重要的影响。因此，在二维培养的情况下，细胞组织对抗癌药的反应与在体内使用情况有较大的差异，导致二维培养条件下构建的肿瘤模型得出的结论对癌症病变和治疗缺少一定的权威性。虽然在抗癌药研究初期，肿瘤组织细胞体外二维培养为肿瘤的研究和治疗起到不可忽略的作用，但是这种存在明显不足的研究方法势必会被新的技术方法取代。随着组织工程的发展，人们对组织工程的应用更加了解。组织工程的目的是通过在支架材料上体外培养受损部位的正常组织细胞，获得可以替代受损组织器官的新再生物。与正常组织细胞相比，肿瘤细胞也是细胞的一种，虽然有其独特的生长微环境，但是也经历细胞的增殖与分化等过程，因此，对培养支架也有共同的要求。受组织工程的影响，组织工程支架材料可以用于肿瘤细胞的体外培养，适合于正常组织细胞生长增殖的组织工程直接也适合与肿瘤细胞的生长。因此，在支架材料的选择上肿瘤细胞与正常细胞具有一致性。经过对肿瘤组织细胞在胶原、蚕丝蛋白等的立体的三维支架中的培养获得的效果表明在组织工程支架材料进行体外培养(三维培养)得到的细胞的行为表达更接近于体内组织，而且观察到二维培养中没有出现的肿瘤细胞典型的凋亡和坏死行为，使我们进一步了解到肿瘤组织在人体内的行为效应。除此以外，肿瘤细胞典型的缺氧诱导因子和血管再生因子等也显著表达。通过对与细胞板二维培养对比，发现在立体支架材料上的三维培养可以提供一个更类似人体组织的微环境。但是目前临床效果较好的支架基材都是胶原或蚕丝蛋白等昂贵的原材料，因此改善现有的支架材料并探索新的支架材料用于肿瘤组织三维体系的体外构建具有非常重要的临床意义和现实意义。在众多的高分子支架材料中，细菌纤维素引起人们的关注。细菌纤维素具有精细的三维的纳米网络结构、良好的力学性能、超高的纯度、显著的透气性能、超强的持水保湿能力、良好的形状维持能力以及良好的生物相容性等。正是由于细菌纤维素具有独特的性能，使其在生物医用领域中具有十分广泛的应用潜力，已被广泛应用于人工皮肤、伤口敷料、人工血管、人工角膜、软骨替代、以及牙齿修复等方面。基于细菌纤维素在组织工程领域取得的大量研究结果，使其在肿瘤细胞的培养上具有了可行性，此外，研究表明，与活性更好的生物大分子相结合可以进一步改善细菌纤维的生物相容性，在前期的研究中发现，在细菌纤维素的纳米纤维表明包覆一层明胶或壳聚糖等，细菌纤维素的生物活性得到显著的改善。众所周知，胶原作为生物活性高分子，在组织工程领域和肿瘤细胞培养领域都得到了广泛的研究，但是其价格昂贵限制了其应用范围，所以选择胶原与细菌纤维素复合制备一种细菌纤维素复合支架，不仅可以保证支架的生物活性与力学强度，同时又可以大大降低胶原的用量，降低支架的制作成本，可以达到双重效果。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种具有微米孔道结构的细菌纤维素/胶原复合材料，并将其应用到肿瘤细胞的体外三维培养中。本发明先将细菌纤维素激光消融造孔处理，再与胶原复合，首次将原花青素用于细菌纤维素和胶原复合材料的制备，使胶原包裹在细菌纤维素的纤维表面，制得细菌纤维素/胶原复合材料，然后首次将其应用到几种肿瘤细胞的体外三维培养。微米孔道引入到细菌纤维素中解决了细菌纤维素中缺少微米大孔的结构缺陷，有利于细胞的长入和营养的运输；胶原引入到细菌纤维素中提高了细菌纤维素的生物活性有利于细胞的粘附、生长和繁殖,满足肿瘤细胞体外培养对支架材料的要求。本发明制备工艺简单，未使用任何有毒药品，安全无毒性。为了解决上述技术问题，本发明一种细胞培养支架材料予以实现的技术方案是 它的组分由下列原料组成细菌纤维素凝胶膜、胶原和原花青素；所述细菌纤维素凝胶膜、 胶原、原花青素的质量比100-200 1-5 4-6;其中，所述细菌纤维素凝胶膜具有微米孔道，所述微米孔道的直径范围为100-300 μ m，所述微米孔道的孔间距为l-2mm。本发明一种细胞培养支架材料的制备方法，经过如下步骤制得a.将细菌纤维素凝胶膜激光消融处理造孔，孔直径为100-300 μ m，孔间距为 l_2mm ；b.将制得的具有微米孔道的细菌纤维素凝胶膜放入l-5g/l的胶原水溶液中， 37 °C恒温浸泡O. 5-2天；C.将上述处理好的凝胶膜取出放入4_6g/l的原花青素溶液中，37°C恒温搅拌 l-3h，即得细菌纤维素/胶原复合材料；d.将制得的细菌纤维素/胶原复合材料取出，清洗干净后，做冷冻干燥灭菌处理， 即得细胞培养支架材料。其中，将细菌纤维素凝胶膜激光消融处理造孔是将所述细菌纤维素凝胶膜置于 JG-1080型数控激光切割机下，加工直径为100-300 μ m的孔，孔间距为l_2mm。进一步讲，本发明细胞培养支架材料中，所述细菌纤维素凝胶膜是由根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、木醋杆菌中的一种或几种微生物发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性备用。所述细菌纤维素凝胶膜优选由木醋杆菌在培养基中发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性，激光消融处理后再用碱液和去离子水多次煮沸清洗至中性备用。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明中，将少量的胶原引入细菌纤维素支架中既可以提高细菌纤维素的生物活性又可以大大减少胶原的用量，降低成本，起到一举两得的作用。本发明首先对细菌纤维素进行激光消融处理，然后制备了细菌纤维素/胶原复合材料，最后将其用于多种肿瘤细胞的体外培养，并得到一系列具有科学意义的实验结果。相比于普通的细菌纤维支架材料，该材料不仅具有更高的生物相容性，而且具有独特的微米孔道结构，满足了组织工程对理想支架材料的要求。这种在生物相容性和微观结构上都满足组织工程支架材料要求的支架将在组织工程领域具有很高的临床应用价值。本发明将具有微米孔道的细菌纤维素与胶原复合，首次以原花青素作为交联剂将胶原包裹在细菌纤维素的纤维表面，制得细菌纤维素/胶原复合材料，然后首次将制备的复合材料用于肿瘤细胞体外三维培养。细菌纤维素中微米孔道的引入解决了普通细菌纤维素缺少微米大孔的缺陷，使其具有独特的微米孔道结构，有利于细胞的长入和营养氧气的运输，将胶原带入改进的细菌纤维素中，进一步改善细菌纤维素的生物活性，有利于细胞的粘附、贴壁、生长和繁殖，满足组织工程支架的要求。本发明使用的激光消融技术是一种纯物理的相互作用，不会进入有毒物质，交联剂原花青素作为可食用的滋补品，安全无毒性。本发明使用的原料廉价易得，成本低。本发明在常压下即可完成材料制备，工艺简单，未使用任何有毒药品，安全无毒性。
照片；图
I是实施例I所得细菌纤维素/胶原复合材料的红外谱2(a)是实施例I所得细菌纤维素凝胶膜的扫描电镜(SEM)照片；
2(b)是实施例I所得细菌纤维素/胶原复合材料的扫描电镜照片；
2(c)是实施例I所得细菌纤维素/胶原复合材料孔壁上纤维结构的扫描电镜
3是实施例I所得细菌纤维素/胶原复合材料和细胞复合体的HE染色照片；
4是实施例I所得细菌纤维素/胶原复合材料和细胞复合体的扫描电镜照片； 5是实施例2所得细菌纤维素/胶原复合材料和细胞复合体的HE染色照片；
6是实施例2所得细菌纤维素/胶原复合材料和细胞复合体的扫描电镜照片； 7是实施例3所得细菌培养支架材料孔壁上纤维结构的扫描电镜照片；
8是实施例3所得细菌纤维素/胶原复合材料和细胞复合体的HE染色照片；
9是细胞在实施例3所得细菌培养支架材料上的细胞生长(MTT)曲线。
具体实施例方式以下通过实施例讲述本发明的详细过程，提供实施例是为了理解的方便，绝不是限制本发明。实施例I :将葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二钠按质量分数分别为2. 5%U%>0. 75%,1% 依次加入烧杯中，用醋酸调节PH值至4.5，115°C高温灭菌30min后取出，作为木醋杆菌生长的液体培养基。木醋杆菌菌种置于琼脂固体培养基中，在4°C下冷藏保存待用。用铁丝在琼脂固态培养基中轻轻划一下，立即浸入IOOml上述制得的液体培养基，30°C振荡培养30h， 摇床转速为160转/分钟，作为木醋杆菌种子溶液备用。
将木醋杆菌种子溶液按照体积比为6%的接种量接种到灭菌后的液体培养基中， 充分振荡使菌液均匀，30°C恒温静置培养5天，得到细菌纤维素凝胶膜。用质量比1%的氢氧化钠溶液清洗至乳白色，再用去离子水洗至中性。将上述制得的细菌纤维素凝胶膜放于激光器(选用JG-1080型数控激光切割机) 的操作台上，按照孔径为150μπκ孔间距为I. 5mm进行激光消融造孔，然后再次清洗多次， 至此制得具有微米孔道的细菌纤维素凝胶膜备用；配制100ml 2. 5g/l的胶原(美国Sigma 公司生产)水溶液，取20g上述具有微米孔道的细菌纤维素凝胶膜放入胶原水溶液中，37°C 恒温充分搅拌，浸泡I天；将上述处理好的凝胶膜取出，放入100ml 5g/l原花青素水溶液中，37°C恒温搅拌2h，反应结束后，即得细菌纤维素/胶原复合材料；将上述制得的细菌纤维素/胶原复合材料取出清洗掉未反应的胶原和原花青素，清洗至不变色，做冷冻干燥灭菌处理，即得本发明产物细胞培养支架材料，备用。综上，本发明制备细胞培养支架材料，首先以原花青素作为交联剂制得细菌纤维素/胶原复合材料，最终形成具有微米孔道的细胞培养支架材料。将本发明细胞培养支架材料应用到肿瘤细胞的体外三维培养中，按照接种浓度为 IXio6细胞/ml的人乳腺癌231细胞，共培养3天，做HE染色和扫描电镜观察。本发明制得的具有微米孔道的细胞培养支架材料，是首次以原花青素作为交联剂制得细菌纤维素/胶原复合材料。图I显示了细菌纤维素/胶原复合材料的红外图谱，谱线上出现了酰胺键的吸收峰，表明了胶原的存在，此外无其他杂质峰，证明制得了成分纯净的细菌纤维素/胶原复合材料。图2 (a)、图2 (b)、图2 (c)显示了具有微米孔道的细菌纤维素/胶原复合材料的扫描照片，显示了复合材料的微观形貌，可以发现在纳米纤维表面包覆的胶原。由图3和图4可知，人乳腺癌231细胞在具有微米孔道的细菌纤维素/胶原复合材料之上有很好的生长状态。实施例2:在实施例2中，将微米孔道的直径设计为180 μ m,孔间距1mm。配制100ml 2g/l的胶原(美国Sigma公司生产)水溶液。取20g激光消融处理的细菌纤维素凝胶膜放入胶原水溶液中，37°C恒温充分搅拌I天。将该凝胶膜取出，放入 100ml 4g/l原花青素水溶液中，37°C恒温搅拌2h。反应结束后，将该凝胶膜取出清洗掉未反应的胶原和原花青素，清洗至不变色，既得细菌纤维素/胶原复合材料，将该复合材料冻干灭菌后既得本发明产物细胞培养支架材料。其他制备条件同实施例I。按照接种浓度为I X IO5细胞/ml的人乳腺癌1028原代细胞，共培养3天，做MTT、 HE染色和扫描电镜观察。图5和图6显示了乳腺癌1028原代细胞在实施例2中制备的支架材料上的生长状况。实施例3 在实施例3中，将微米孔道的直径设计为300 μ m,孔间距1mm。配制100ml 3g/l的胶原(美国Sigma公司生产)水溶液。取20g激光消融处理的细菌纤维素凝胶膜放入胶原水溶液中，37°C恒温充分搅拌I天。将该凝胶膜取出，放入100ml 6g/l原花青素水溶液中，37°C恒温搅拌2h。反应结束后，将该凝胶膜取出清洗掉未反应的胶原和原花青素，清洗至不变色，既得细菌纤维素/胶原复合材料，将复合材料冻干灭菌既得本发明产物细胞培养支架材料。其他制备条件同实施例I。按照接种浓度为I X IO5细胞/ml的人乳腺癌231细胞，共培养7天，做MTT、HE染色和扫描电镜观察。图7显示了实施例3中支架的微米孔道，图8显示了乳腺癌231细胞系在实施例 3中制备的支架上的生长状况。图9实施例3中细胞在所制备支架上的MTT曲线。实施例4 在实施例4中，将微米孔道的直径设计为150 μ m,孔间距1mm。配制100ml 5g/l的胶原(美国Sigma公司生产)水溶液。取20g激光消融处理的细菌纤维素凝胶膜放入胶原水溶液中，37°C恒温充分搅拌I天。将凝胶膜取出，放入IOOml 6g/l原花青素水溶液中，37°C恒温搅拌2h。反应结束后，将凝胶膜取出清洗掉未反应的胶原和原花青素，清洗至不变色，既得细菌纤维素/胶原复合材料，将复合材料冻干灭菌既得本发明产物细胞培养支架材料。其他实验条件同实施例I。按照接种浓度为I X IO4细胞/ml的病患的乳腺癌肿瘤原代细胞，共培养14天，做 MTT、HE染色和扫描电镜观察，实验结果与上述几个实例中变化规律类似，这里不再一一赘述。尽管上面结合图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式
，上述的具体实施方式
仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以作出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。
权利要求
1.一种细胞培养支架材料，其特征在于，它的组分由下列原料组成细菌纤维素凝胶膜、胶原和原花青素；所述细菌纤维素凝胶膜、胶原、原花青素的质量比 100-200 1-5 4-6;其中，所述细菌纤维素凝胶膜具有微米孔道，所述微米孔道的直径范围为100-300 μ m，所述微米孔道的孔间距为l-2mm。
2.根据权利要求I所述的细胞培养支架材料，其特征在于，所述细菌纤维素凝胶膜是由根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、木醋杆菌中的一种或几种微生物发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性备用。
3.根据权利要求2所述的细胞培养支架材料，其特征在于，所述细菌纤维素凝胶膜是由木醋杆菌在培养基中发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性， 经激光消融造孔处理后再用碱液和去离子水多次煮沸清洗至中性备用。
4.一种细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于，经过如下步骤制得a.将细菌纤维素凝胶膜激光消融造孔，孔直径为100-300μ m，孔间距为l_2mm ;b.将制得的具有微米孔道的细菌纤维素凝胶膜放入l_5g/l的胶原水溶液中，37°C恒温浸泡O. 5-2天；c.将上述处理好的凝胶膜取出放入4-6g/l的原花青素溶液中，37°C恒温搅拌l_3h，即得细菌纤维素/胶原复合材料；d.将制得的细菌纤维素/胶原复合材料取出，清洗干净后，做冷冻干燥灭菌处理，即得细胞培养支架材料。
5.根据权利要求4所述的细胞培养支架材料的制备方法，，其特征在于，所述细菌纤维素凝胶膜是由根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、木醋杆菌中的一种或几种微生物发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性备用。
6.根据权利要求4所述细胞培养支架材料的制备方法，其中，将细菌纤维素凝胶膜激光消融造孔是将所述细菌纤维素凝胶膜置于JG-1080型数控激光切割机下，加工直径为 100-300 μ m的孔，孔间距为I-2mm。
7.根据权利要求4所述细胞培养支架材料的制备方法，其中，所述细菌纤维素凝胶膜是由木醋杆菌在培养基中发酵制得，用碱液多次煮沸清洗至乳白色再用去离子水洗至中性，激光消融处理后再用碱液和去离子水多次煮沸清洗至中性备用。
全文摘要
本发明公开了一种细胞培养支架材料及其制备方法，它的组分由下列原料组成细菌纤维素凝胶膜、胶原和原花青素；所述细菌纤维素凝胶膜、胶原、原花青素的质量比100-200∶1-5∶4-6；其中，所述细菌纤维素凝胶膜具有微米孔道，所述微米孔道的直径范围为100-300μm，所述微米孔道的孔间距为1-2mm。本发明首次用原花青素制得细菌纤维素/胶原胶复合材料，进而将其用于肿瘤细胞的体外三维培养。本发明提供的复合材料具有良好的力学性能、独特的三维纳米网络结构、特殊的微米孔道结构以及良好的生物相容性，在结构和成分上更加满足人们对组织工程材料的要求。本发明所用试剂安全无毒性，成本低，制备工艺简单。
文档编号C08J9/40GK102600507SQ201210059979
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者万怡灶, 朱勇, 李群英, 王静, 罗红林 申请人:天津大学