专利名称：模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种化工技术领域的方法，具体是一种模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法。
背景技术：
荧光聚合物拥有优异的光学性质，因而在医药、生物、化工等方面具有广泛和重要的应用。模仿生物发光的基本原理，开发一种新型的荧光聚合物，具有重要的意义。经对现有技术的文献检索发现，目前制备荧光聚合物的方法主要是利用荧光小分子作为聚合物的结构单元，通过偶联反应制备共轭型突光聚合物。例如，Yamamoto等在《Polymer》(聚合物，2007年，48 卷，5449 5472 页)上发表了“Synthesis of n -conjugatedpolymers bearing electronic and optical functionalities by organometallicpolycondensations and their chemical properties”(利用有机金属缩合反应制备具有光电性能的η共轭聚合物及其化学性质研究)，该文采用过渡金属如镍、钯等作为催化剂，制备了一系列具有不同结构和性能的荧光聚合物。然而，这种方法制备的荧光聚合物，减弱了荧光分子本身的光学性能。此外，该类共轭聚合物难以降解，并具有很高的细胞毒性，因此无法应用于活体成像能生物医用领域。理想的生物成像荧光材料应该是充分利用荧光基团，获得性能更好的荧光材料，同时具有优异的生物相容性。向自然界生物发光学习，充分利用荧光基团，发展新的生物相容性荧光聚合物的制备方法，无疑具有重要的科学和应用价值。绿色荧光蛋白是一种利用蛋白质技术而合成的新型蛋白质，可利用此种蛋白作为标记，在现代生物工程中具有重要意义。其化学本质为蛋白质，由氨基酸脱水缩合而成，是一种高分子化合物。由于具有近似完美的圆柱体结构，绿色荧光蛋白展现出独特和优异的荧光性质。当处于初级结构时，由于产生荧光的生色团可以自由旋转，绿色荧光蛋白的荧光非常弱。一旦通过自组装形成圆柱体结构，生色团的自由旋转受到抑制，绿色荧光蛋白获得了优异的荧光性能。现有技术中未有研究人员利用这一生物自组装获得优异荧光性能原理，来设计和开发一类新型的荧光聚合物。综上所述，现有的荧光聚合物的制备方法存在制作出来的荧光聚合物难以降解、具有很高的细胞毒性、由此无法应用于活体成像等生物医用领域的技术问题
发明内容
本发明的目的在于提供一种模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，以解决现有的荧光聚合物制备方法的局限性的技术问题。一种模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，包括以下步骤
第一步将绿色荧光蛋白生色团或其类似物与对甲基苯磺酰氯活化的聚乙二醇加入有机溶剂中，在高温下搅拌、水洗、沉淀，得到生色团修饰的聚乙二醇；
第二步将所得到的生色团修饰的聚乙二醇进行聚合反应，得到模拟绿色荧光蛋白的新型两亲性荧光聚合物。聚合反应作包括以下步骤
在三乙胺催化下，将溴代异丁酰溴与生色团修饰的聚乙二醇反应，水洗，冰乙醚沉淀，制备溴代生色团聚乙二醇；
以溴代生色团聚乙二醇为引发剂，引发疏水单体的原子转移自由基聚合，制备两亲性荧光聚合物。聚合反应也可以包括以下步骤将生色团修饰的聚乙二醇溶解于有机溶剂中，弓丨发疏水性单体的开环聚合，制备两亲性荧光聚合物。在高温下搅拌进一步包括在高于80°C的温度下搅拌24小时。所述第一步中的绿色荧光蛋白生色团或其类似物包括含羟苯亚甲基咪唑啉酮的荧光生色团。第一步中的有机溶剂包括以下溶剂的其中之一乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺。疏水单体为以下其中之一或其组合甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸甲酯、其它含甲基丙烯酸酯或者丙烯酸酯的化合物。原子转移自由基聚合为以溴代生色团聚乙二醇为引发剂，利用甲苯作为溶剂，在溴化亚铜和联吡啶作用下，加入含甲基丙烯酸酯或者丙烯酸酯的化合物，于80°C反应8小时。将生色团修饰的聚乙二醇溶解于有机溶剂中为以下溶剂的其中之一甲苯、二甲亚砜或者二甲基甲酰胺。弓I发疏水性单体的开环聚合中的疏水性单体为己内酯或者丙交酯。引发疏水性单体的开环聚合中的开环聚合为辛酸亚锡或者三乙基铝为引发剂，氮气或者氩气保护下的己内酯或者丙交酯的聚合。由于具有近似完美的圆柱体结构，绿色荧光蛋白展现出独特和优异的荧光性质。当处于初级结构时，由于产生荧光的生色团可以自由旋转，绿色荧光蛋白的荧光非常弱。一旦通过自组装形成圆柱体结构，生色团的自由旋转受到抑制，绿色荧光蛋白获得了优异的荧光性能。本发明利用这一生物自组装获得优异荧光性能原理，设计和开发了一类新型的荧光聚合物。即将所得到的新型两亲性荧光聚合物溶于水来得到优异的荧光性能。因此，本发明是模拟绿色荧光蛋白的结构及自组装增强荧光性能的原理，利用与绿色荧光蛋白相似的生色团构建两亲性聚合物，并采用自组装方法实现聚合物荧光的增强。本发明合成的荧光聚合物，具有以下特点一是聚合物链上只有一个荧光生色团；二是聚合物本身具有两亲性，可以自组装；三是聚合物组装后，其荧光性能明显增强。相对于传统的荧光聚合物，本方法得到的聚合物容易设计和制备，并能用于生物成像，显示了良好的应用前景。
图I为本发明制备的荧光聚合物的核磁氢谱；
图2为本发明制备的荧光聚合物通过自组装荧光增强图(a)聚合物组装前荧光发射图；(b)聚合物组装后荧光发射图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例I
第一步将O. 90-1. 00克荧光生色团类似物、2. 60-2. 80克无水碳酸钾和2. 00-2. 20克甲基苯磺酰氯化的聚乙二醇，溶于100-200毫升乙腈，110°C回流24小时。冷却至室温，去除乙腈，用二氯甲烷溶解产物，水洗，沉淀，得到荧光生色团修饰的聚乙二醇。第二步将600-700毫克生色团修饰的聚乙二醇溶于15-20毫升二氯甲烷中，冷却至0°c，分别缓慢加入O. 30-0. 40毫升三乙胺和O. 30-0. 40毫升溴代异丁酰溴，反应24小时。混合物用二氯甲烷稀释，水洗，沉淀，得到溴代生色团的聚乙二醇。
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第三步用2. 0-2. 4毫升甲苯溶解25-30毫克溴化亚铜和70_90毫克联吡啶，再分别加入200-240毫克溴代生色团的聚乙二醇和2. 0-2. 4毫升甲基丙烯酸甲酯，于80°C反应8小时。产物用四氢呋喃溶解，沉淀，得到两亲性荧光聚合物。实施例2
第一步将O. 90-1. 00克荧光生色团类似物、2. 70-2. 80克无水碳酸钾和2. 00-2. 10克甲基苯磺酰氯化的聚乙二醇，溶于100-200毫升乙腈，110°C回流24小时。冷却至室温，去除乙腈，用二氯甲烷溶解产物，水洗，沉淀，得到荧光生色团修饰的聚乙二醇。第二步用10-15毫升甲苯溶解210-230毫克生色团修饰的聚乙二醇，再加入20-30毫克的辛酸亚锡，氮气保护下，于80°C反应32小时，得到两亲性荧光聚合物。本发明所得到的产物经一维核磁氢谱、一维核磁碳谱、傅里叶变换红外光谱、凝胶渗透色谱、紫外可见吸收光谱、荧光发射光谱测试来证明其结构和性质。实施例结果见附图。图I对应实施例I制备的荧光聚合物的一维核磁氢谱谱图。其中，3. 66-3. 64 ppm对应的是聚乙二醇重复单元的亚甲基的峰，3. 63-3. 56 ppm代表的是聚甲基丙烯酸甲酯的甲氧基的峰，2. 06-1. 42 ppm是聚甲基丙烯酸甲酯的亚甲基的峰，1.01-0. 84 ppm对应的是聚甲基丙烯酸甲酯的甲基的峰。该谱图证明了荧光聚合物的成功制备。图2对应实施例I制备的荧光聚合物的组装荧光增强结果。在图中，(a)代表的是聚合物组装前的荧光发射谱图，(b)代表的是聚合物组装后的荧光发射谱图，两者浓度相同。从图中可以明显观察到荧光增强现象，组装后的荧光强度是组装前的24倍。总之，通过模拟绿色荧光蛋白的结构和自组装方法，我们设计合成了一种新型的荧光聚合物，并利用自组装明显提高了其荧光性能。本发明创新的是一类新型的荧光聚合物，由疏水性聚合物、荧光生色团和亲水性聚合物连接组成，亲/疏水聚合物比例在O. 2-0. 8之间，有望应用于生物、医学、药学等领域。此处公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式
。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属领域技术人员能很好地利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
权利要求
1.一种模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 第一步将绿色荧光蛋白生色团或其类似物与对甲基苯磺酰氯活化的聚乙二醇加入有机溶剂中，在高温下搅拌、水洗、沉淀，得到生色团修饰的聚乙二醇； 第二步将所得到的生色团修饰的聚乙二醇进行聚合反应，得到模拟绿色荧光蛋白的新型两亲性荧光聚合物。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，聚合反应作包括以下步骤 在三乙胺催化下，将溴代异丁酰溴与生色团修饰的聚乙二醇反应，水洗，沉淀，制备溴代生色团聚乙二醇； 以溴代生色团聚乙二醇为引发剂，引发疏水单体的原子转移自由基聚合，制备两亲性荧光聚合物。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，聚合反应包括以下步骤 将生色团修饰的聚乙二醇溶解于有机溶剂中，引发疏水性单体的开环聚合，制备两亲性荧光聚合物。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，在高温下搅拌进一步包括在高于80°C的温度下搅拌24小时。
5.如权利要求I所述的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于所述第一步中的绿色荧光蛋白生色团或其类似物包括含羟苯亚甲基咪唑啉酮的荧光生色团。
6.如权利要求I所述的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于第一步中的有机溶剂包括以下溶剂的其中之一乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺。
7.如权利要求2所述的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于疏水单体为以下其中之一或其组合甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸甲酯、其它含甲基丙烯酸酯或者丙烯酸酯的化合物。
8.如权利要求2所述的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于原子转移自由基聚合为 以溴代生色团聚乙二醇为引发剂，利用甲苯或者二甲基甲酰胺作为溶剂，在溴化亚铜和联吡啶作用下，加入含甲基丙烯酸酯或者丙烯酸酯的化合物，于80°C反应8小时。
9.如权利要求3所述的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于将生色团修饰的聚乙二醇溶解于有机溶剂中为以下溶剂的其中之一甲苯、二甲亚砜或者二甲基甲酰胺。
10.如权利要求3所述的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于弓丨发疏水性单体的开环聚合中的疏水性单体为己内酯或者丙交酯。
11.如权利要求I所述的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法，其特征在于弓丨发疏水性单体的开环聚合中的开环聚合为辛酸亚锡或者三乙基铝为引发剂，氮气或者氩气保护下的己内酯或者丙交酯的聚合。
全文摘要
本发明公开一种化工技术领域的模拟绿色荧光蛋白的荧光聚合物的制备方法。本发明受绿色荧光蛋白通过自组装提高自身荧光性能原理的启发，将含羟苯亚甲基咪唑啉酮的荧光生色团引入到两亲性聚合物中，得到了一类新型的两亲性荧光聚合物，并通过大分子自组装实现了聚合物的荧光增强。这类聚合物制备简单，可设计性强，并且可以通过自组装的方法增强其荧光性能。这是一类新型的荧光聚合物，由疏水性聚合物、荧光生色团和亲水性聚合物连接组成，亲/疏水聚合物比例在0.2-0.8之间，有望应用于生物、医学、药学等领域。
文档编号C08F283/06GK102675556SQ20121011439
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者朱新远, 朱琦, 朱邦尚, 邓洪平 申请人:上海交通大学