专利名称：泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向ct造影剂的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于靶向CT造影剂的制备领域，特别涉及一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法。
背景技术：
计算机断层扫描(CT)成像技术由于具有较高的空间分辨率，使用方便有效，目前在临床上各种疾病尤其是癌症的早期诊断和治疗中已得到了广泛的应用，为了增强CT成像效果，达到满足需要的成像质量，造影剂就变得非常必要。传统的CT成像剂通常是一些含碘的小分子化合物，例如碘海醇、碘化油、碘番酸和泛影酸等，这些小分子成像剂存在许多缺点，它们的血液循环时间短，时间成像短，而且缺乏特异性，不能对组织进行靶向成像，同时在高剂量下又有一定的肾脏毒性。
文献报道提出可以将小分子含碘化合物与有机大分子相连，以延长其血液循环时间，2010 年 Francois Hallouard 等人[Francois Hallouard, Nicolas Anton, PhilippeChoque et al. Iodinated blood pool contrast media for preclinical X-ray imagingapplications一A Review. Biomaterials 2010; 31:6249-6248]对改进的含碘大分子成像剂进行了系统总结，通过增大分子量的方法虽然使血液循环时间得到了延长，但是成像的效果依然有待提闻。金(Au)元素与碘(I)元素相比由于具有更高的原子序数和电子密度，引起了越来越多科研工作者的关注，它可以对X-射线产生很强的吸收，从而产生显著的X-射线衰减。将纳米金颗粒和含碘小分子造影剂结合起来可以大大提高CT成像的灵敏度。郭眷等人在 2011 年[RuiGuo, Hanffang, ChenPeng et al. Enhanced X-ray attenuationproperty of dendrimer—entrapped gold nanoparticles complexed with diatrizoicacid. 2011;21:5120-5127]首次以第五代聚酰胺-胺树状大分子为模版，制备树状大分子包裹得纳米金颗粒(Au DENPs) (Au:G5.NH2=50:l，摩尔比，下同)，之后和含碘的泛影酸(DTA)络合将金和碘两种成像元素结合在同一体系中，实现了双元素增强成像。在继续的研究工作中(中国发明专利，申请号201110332471.9.)，本课题组又发现连接了泛影酸的 G5. NH2-DTA对氯金酸具有一定的自还原能力(Au:G5. NH2-DTA=50:1时比较稳定)，也可得到含DTA的树状大分子稳定的纳米金颗粒(Au DSNPs)。但是在以前这些工作中，一方面金的上载量相对有限(Au:G5.NH2=50:l)，成像灵敏度有待提高；另一方面上述工作没有涉及到革巴向成像造影剂的制备。总结目前的研究发现，同时含有金和碘两种成像元素而且又具有靶向功能的CT造影剂的研究还未见文献报道和专利申请。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种泛影酸修饰的包含金和碘的靶向CT造影剂的制备方法，该方法操作简便，条件温和，易于操作，具备将来产业化实施的可能性，得到的靶向CT造影剂成像效果好，且具有良好的水溶性和生物相容性。本发明的一种泛影酸修饰的包含金和碘的靶向CT造影剂的制备方法，具体包括(2)将氯金酸水溶液加入到末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5. NH2)(从美国Dendritech公司购买)水溶液中，搅拌后加入NaBH4还原，持续搅拌30min后分别加入HCl水溶液和NaOH水溶液以调节溶液的pH为中性；( 2)将步骤(I)得到的溶液继续重复步骤(I)所述的操作3次，直到金元素全部上载到树状大分子内，最后分别用PBS和去离子水透析，得到Au NPs水溶液，无需干燥继续下列反应；(3)将泛影酸(DTA)、l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC .HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)分别溶解在DMSO中，然后将EDC -HCl的DMSO 溶液加入到DTA的DMSO溶液中搅拌2h，再加入NHS的DMSO溶液继续搅拌2h，以活化DTA上的羧基，得到活化好的DTA溶液；将所述的活化好的DTA溶液逐滴滴加到步骤(2)得到的Au NPs水溶液中，持续搅拌反应2-5d，然后依次用PBS和去离子水透析，得到{(Au0) 120-G5.NH2-DTA}的纳米复合物，无需干燥继续下列反应；(5)将EDC -HCl和NHS溶解于水中，在水相体系中分别活化羧基化的聚乙二醇_叶酸FA-PEG-C00H (先用EDC、NHS活化FA，然后将活化体系滴加到NH2-PEG-C00H中持续搅拌反应3d，透析后得到FA-PEG-C00H)和羧基化的聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH，然后将活化后的FA-PEG-C00H加入到步骤(3 )得到的{(Au0) 120-G5. NH2-DTAj的水溶液中，反应3天，再加入活化后的mPEG-COOH，反应3天，之后在三乙胺存在下用乙酸酐将树状大分子表面剩余的氨基全部乙酰化，最后分别用PBS和去离子水透析，冷冻干燥透析液，即得固体产物{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA- (PEG-FA) -mPEG} DSNPs。步骤(I)中所述的末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子水溶液中G5. NH2的浓度为I I. 5mg/mL。步骤(I)中的所述的各原料之间的摩尔比为G5. NH2:HAuCl4:NaBH4:HCl:NaOH=I: 30:150:150:150。步骤(I)中所述的氯金酸水溶液的浓度为30mg/mL。步骤(I)中所述的HCl水溶液和NaOH水溶液的浓度均为0. 3mol/L。步骤(2)中所述的金元素与G5. NH2的摩尔比为120 :1。步骤(3)中所述的泛影酸、1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和G5. NH2的摩尔比为200:1000:1000:1.。步骤(3)中所述的活化好的DTA溶液中DMSO与AuNPs水溶液中水的体积比为1: 4。步骤(3)中所述的透析为先用pH值为7. 4的PBS透析一天(每次4L，共3次)，再用去离子水透析一天(每次4L，共3次)。步骤(4)中所述的FA-PEG-C00H、mPEG_C00H 与{(Au0) 120-G5. NH2-DTAj 的摩尔比为10:10:1。步骤(4)中所述的透析为先用PBS透析一天(每次4L，共3次)，再用去离子水透析一天(每次4L，共3次)。步骤(4)所述的整个反应在水相体系中进行。本发明的步骤(I)和(2)中采用的是逐次还原氯金酸的方法，选用0. 3mol/L的盐酸和氢氧化钠溶液来调节反应体系pH值，每次还原30eq (Au:G5. NH2=30:1,摩尔比)，总共重复反应4次，使120eq的氯金酸上载到树状大分子内，形成平均粒径为3. 4nm的AuDENPs。本发明的步骤(3)中制备得到的{(Au°) 12(|-G5. NH2_DTA}纳米复合物的溶液必须先用PBS透析一天，以除掉静电离子形式结合在G5. NH2表面的DTA，再用去离子水透析2d。本发明采用了一种逐次还原的方法使更高含量的纳米金上载到树状大分子内，并且连接了聚乙二醇(mPEG-COOH和FA-PEG-C00H)和靶向分子叶酸(FA)，使之具有良好的生物相容性和水溶性，并有望应用于肿瘤的靶向成像。本发明使碘和更多量的金上载到G5. NH2上，并且连接靶向分子以使其具有靶向成 像作用，此外还要用聚乙二醇进行修饰，一方面可以进一步延长血液循环时间，另一方面可以增加其生物相容性。通过各种技术表征证明了 PEG-FA分子成功连接到G5. NH2上，体外CT扫描说明两种元素的协同作用大大增强了其成像灵敏度，MTT测试则说明该材料在给定浓度范围内具有极低的毒性。本发明采用UV-Vis，1H NMR, FTIR，TEM等技术表征方法对复合物纳米粒子进行了相关的表征，利用Micro-CT对材料进行了体外CT显影效果测试，又通过MTT毒性测试对其细胞毒性进行了考察。(I)紫外可见分光(UV-Vis)光谱通过UV-Vis光谱测试结果(附图I)可以看出，在524nm左右的峰即为金纳米粒子的表面等离子体共振峰，随着后续功能化反应的进行，吸收峰并未发生明显的偏移，说明制备的AuNPs很稳定，乙酰化后的微小偏移则是因为失去了氨基之间的静电排斥作用以后，颗粒稍微有所增大，但并无沉淀产生。通过对不同温度(4 50°0和不同pH (5^8)条件下的稳定性测试更表明了材料在上述条件变化范围内是非常稳定的(附图2)。此外还考察了 {(AU°)12CI-G5.NHAc-DTA- (PEG-FA) -mPEG} DSNPs纳米粒子体系在PBS和细胞培养液中的溶解性和稳定性，利用照片(附图3)显示了该纳米粒子体系在PBS和细胞培养液中是很稳定的。 (2)核磁共振氢谱(1HNMR)谱根据1H NMR结果(附图4)，我们由积分面积计算出分别有9个mPEG和6个PEG-FA连接到了 G5. NH2表面，由于计算得到树状大分子含有59个乙酰基，于是由差减法得出DTA的上载量为30，因此最终所得纳米粒子可记作{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9}DSNPs。但是在上述核磁谱中看不到DTA的峰，我们猜想可能是因为它的峰与G5. NH2的亚甲基峰发生了重叠。(3)傅里叶变换红外光谱(FTIR)通过FTIR谱图比较发现(附图5)，图谱中波数1453、1366、1279、1251和952、786CHT1处的峰均属于DTA的特征吸收峰，而且1712CHT1处的C=O伸缩键向低波数方向发生了红移，这可能是由于G5. NH2上的氨基和DTA的羧基生成了酰胺键的结果。这些都充分证实了 DTA已被成功连接到了树状大分子表面。(4)透射电镜(TEM)TEM照片分别记录了金纳米粒子在反应过程中从{(Au0) 120-G5. NH2IDENPs, {(Au。) 12Q-G5. NH2-DTA3tl-(PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs 到乙酰化后的{(Au。)12(I-G5.NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs的粒径变化，粒径分布柱状图则反映Au NPs粒径分布的均匀性(附图6)，比较发现随着后续功能化和乙酰化的进行，AuNPs粒径有所增大，由AuDENPs 5nm)转变到了 Au DSNPs 5nm)，但是分布比较均匀，而且分散性良好。图7中Ca)是{(Au。) 12Q-G5. NHAc-DTA3q-(PEG-FA)6-mPEG9}DSNPs 的高分辨 TEM 照片，(b)是选区电子衍射照片，(c)是EDS能谱图。证明纳米金颗粒呈面心立方多晶态结构。EDS能谱图证明了金元素的存在。(5)表面电势测定{(Au0) 120-G5. NH2-DTA3q-(PEG-FA) 6iPEG9} DSNPs 在水溶液中的表面电势为26. 5± I. OmV,经乙酰化得到{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3q-(PEG-FA)6_mPEG9}DSNPs 之后在水溶液中的表面电势为1.5±0.6mV。这表明乙酰化反应的成功进行。(6)体外CT成像CT成像比较直观的给出了材料的X-射线衰减效应，由附图8 (a)和(b)可以看出在有效成像元素(Au/I)浓度一致的情况下，我们制备的双元素CT造影剂比单独的纳米金造影剂(a)或者单独的碘造影剂(b)具有更强的X-射线吸收，也就是说单位摩尔数时，双元素CT造影剂拥有更好的成像效果。(6) MTT毒性测试将不同浓度的{(Au0) 120-G5. NH2-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9} DSNPs 和{ (Au0) 120-G5.NHAc-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9} DSNPs与KB细胞(人口腔上皮癌细胞)共培养24h，然后加MTT再培养4h，之后加DMSO并置于摇床内震荡l(T20min，用酶标仪进行测试。实验结果(附图9)表明，当该双元素CT造影剂的浓度达到2000nM时，细胞毒性仍然不明显，这说明{ (Au0) 120-G5. NHAc-DTA3q-(PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs 在 2000nM 时仍显示出比较好的生物相容性。相反，没有乙酰化处理的{ (Au0) 120-G5. NH2-DTA30- (PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs在浓度为500nM时即显示对细胞具有明显的毒性。(7)细胞形貌将最终制备得到的{(Au0)120-G5. NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6iPEG9} DSNPs 纳米颗粒用PBS溶液配制成不同浓度(分别为100，300，500，1000,和2000nM)，与KB细胞共培养24h，然后利用相差显微镜观察不同浓度材料处理后的细胞形貌变化，进而评估该材料对细胞形态的影响。显微镜照片如附图10，通过与对照组对比发现，随着材料浓度的依次增大，细胞形貌并未发生明显的改变，多数均呈现生长状况良好的梭形，这说明该材料对细胞的生长无明显影响，也从细胞形态方面进一步证实其细胞毒性较小。(8 )细胞靶向性CT扫描测试利用体外CT扫描对制备得到的双元素靶向CT造影剂{(Au0) 120-G5.NHAc-DTA3O-(PEG-FA)6-mPEG9}DSNPs的细胞靶向性进行测试，不含叶酸(FA)的{(Au0) 120-G5. NHAc-mPEG18} DSNPs作为对照组。将配制好的不同浓度的{(Au0) 120_G5.NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6-mPEG9}和{(Au°) 12(I-G5. NHAc_mPEG18}分别与表面表达高叶酸受体的KB细胞共培养3h，将上述两组细胞用PBS缓冲液清洗，然后进行消化离心处理，并转移到I. 5mL的离心管中，通过体外CT扫描测试其靶向性(见附图11)。CT值(HU)越大说明细胞 吞噬的材料越多，数据显示连接了 FA的{(Au°)12CI-G5. NHAc-DTA3ci-(PEG-FA)6-mPEG9}双元素靶向CT造影剂具有良好的癌细胞靶向性。这种泛影酸修饰的树状大分子稳定的金纳米颗粒，同时携带金和碘两种成像元素，对X-射线具有更强的吸收。乙酰化后的纳米颗粒性质稳定，粒径分布也比较均匀，而且通过乙酰化降低了毒性，增加了材料的生物相容性，FA基团又赋予它靶向成像的能力，这些都为该双元素靶向CT造影剂将来应用于临床进行癌症的早期诊断和治疗奠定了良好的基础。有益效果(I)本发明的制备方法操作简便，条件温和，易于操作，具备将来产业化实施的可倉泛十生;(2)本发明设计的制备方法，可以使更高量的金(Au:G5.NH2=120:l)上载到树状大分子内，又加之另一成像元素碘的作用，从而拥有更好的成像效果。制备的材料性质稳定，具有良好的水溶性和生物相容性。(3)本发明还引入了 PEG和FA，不仅可以延长材料的血液循环时间，还赋予材料靶向成像的能力，为其将来应用于临床靶向CT成像奠定了基础。
图I 为本发明制备的{(Au°)12Q-G5. NHJ DENPs, {(Au。)12Q-G5.NH2-DTA30I DSNPs, { (Au0) 120-G5. NH2-DTA30-(PEG-FA) 6-mPEG9}和{ (Au0) 120-G5.NHAc-DTA30-(PEG-FA)6-mPEG9}DSNPs 的紫外吸收光谱图；图2 为本发明制备的{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3q- (PEG-FA) 6_mPEG9} DSNPs 在(a)PH=5-8范围和(b)温度为4°C，25°C，37°C，50°C时测得的紫外吸收光谱图；图3 为本发明制备的{ (Au0) 120-G5. NHAc-DTA30-(PEG-FA)6-mPEG9} DSNPs 在细胞培养液(2)和PBS (3)中的溶液照片，I为未添加材料的细胞培养液照片；图4 为本发明制备的{(Au0) 120-G5. NH2-DTA30- (PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs 的核磁共振氢谱谱图；图5 为 DTA、G5. NH2 和本发明制备的{(Au0) 120-G5. NH2-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9}DSNPs 的 FTIR 谱图；图6 分别为本发明制备的{(Au°) 12Q-G5.NH2} DENPs (a)、{(Au0) 120_G5.NH2-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9} DSNPs (b)和{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9}DSNPs(c)的透射电镜图片及其粒径分布柱状图；图7 为本发明制备的{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3q- (PEG-FA) 6_mPEG9} DSNPs 的高分辨TEM照片(a)，选区电子衍射照片(b)和EDS能谱图(c)；图8 Ca)为随Au浓度变化时本发明制备的{(Au0) 120_G5. NHAc-mPEG18}和{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA30-(PEG-FA)6-mPEG9}的 CT 值变化曲线；(b)为随 I 浓度变化时，欧乃派克(Omnipaque)和本发明制备的{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3q- (PEG-FA) 6iPEG9}的 CT 值变化曲线；图9 为本发明制备的{(Au。) 12Q-G5. NH2-DTA3tl-(PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs 和{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3ci-(PEG-FA) 6iPEG9} DSNPs 与 KB 细胞共培养 24h 后所测得的 MTT 细胞毒性结果；
图10 为不同浓度的{(Au。)12Q-G5. NHAc-DTA3q-(PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs 与 KB 细胞共培养24h后用相差显微镜拍得的细胞形貌照片；
图11 为本发明制备的不同浓度下{(Au°) 12Q-G5. NHAc-DTA3q-(PEG-FA)6-mPEG9}和{(Au0) 120-G5. NHAc-mPEG18}与表面表达高叶酸受体的KB细胞共培养3h后，各组细胞的体外CT值；图12 Ca)为本发明制备{(Au°) 12Q-G5. NH2I DENPs过程的简易流程图；(b)为将金纳米粒子功能化进而得到{(Au0) 1 20-G5. NHAc-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9} DSNPs过程的简易流程图；图13 为对比例 I 中{(Au0) 120-G5. NHAc-PEG18I 的核磁谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I每次将30eq (与G5. NH2的摩尔比，下同)的氯金酸加入到末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5. NH2)水溶液中，搅拌lOmin，然后加入150eq的NaBH4还原，持续搅拌30min后分别加入150eq的HCl和NaOH (均为0. 3mol/L)以调节溶液pH为中性，然后重复上述过程3次，直到120eq的金上载到树状大分子内，该反应控制G5. NH2的浓度在Img/mL左右。最后分别用PBS和去离子水透析得到Au NPs溶液，所用再生纤维素透析袋的截留分子量为MWC0=14000，无需干燥继续实施例2的反应。实施例2将200eq的泛影酸(DTA)溶解在二甲亚砜(DMSO)中，IOOOeq的1_(3_ 二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC. HCl)和IOOOeq的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)也分别溶解在DMSO中，先将EDC加入DTA溶液中搅拌2h，再加入NHS继续搅拌2h，以活化DTA上的羧基，最后将活化好的DTA溶液逐滴滴加进(I)中透析好的Au NPs的水溶液中，控制DMSO:水=1:4 (v: V)，持续搅拌反应3天，然后先用pH=7. 4的PBS缓冲液透析I天(3次，4升/次)，再用去离子水透析I天(3次，4升/次)，得到{(Au0) 120-G5. NH2-DTAj的纳米复合物，无需干燥继续实施例3的反应；实施例3分别将 IOeq 的 FA-PEG-COOH 和 IOeq 的 mPEG-COOH 依次和{(Au0) 120-G5. NH2-DTAj的纳米颗粒反应，实验中EDC. HCl和NHS均溶解于水中，在水相体系活化C00H-PEG-FA和mPEG-COOH,然后依次加入到{(Au0) 120-G5. NH2-DTAj的水溶液中，分别反应3天，然后在三乙胺存在下用乙酸酐将树状大分子表面剩余的氨基全部乙酰化，再分别用PBS和去离子水透析，冷冻干燥，即得固体产物{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs。 其中每步所得金纳米粒子透析后均用UV-Vis光谱仪进行测试，在524nm左右可以明显看到金纳米粒子的表面等离子共振峰(附图1)，其粒径和形状变化用TEM进行了测试(附图6)，核磁共振氢谱(附图4)中通过对积分面积的计算得出连接上的mPEG为9个，PEG-FA为6个，DTA为30个。傅里叶变换红外光谱图(附图5)则证实了 DTA确已连接到PAMAM树状大分子上。
实施例4配制一定浓度(约0. 5mg/ml)的{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3q- (PEG-FA) 6_mPEG9}的水溶液，首先考察材料对PH的耐受性调节水溶液pH值依次为5、6、7、8，分别测其在各pH值下的紫外吸收曲线，见附图2 (a)，各曲线没有发生明显的偏移，说明该材料在pH=5-8范围内很稳定。再考察材料对温度的耐受性将配好的溶液置于4°C条件下放置30min，然后立即用紫外可见分光光度计测得其在此温度下的吸收曲线，如此分别将溶液依次放置于25°C、37°C、50°C下，分别放置30min后立即测其紫外可见吸收曲线，结果见附图2 (b)，不同温度下得到的各吸收曲线没有发生明显的偏移，这说明材料在上述温度范围内很稳定。实施例5通过体外CT扫描测试来考察实施例3所制备材料的成像效果，CT值用HU表示。对比材料分别为欧乃派克和自制的不包含DTA的金纳米粒子{(Au°) 12(i-G5. NHAc-PEG18I，其中配制的金元素的浓度分别0.01,0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0. 10，0. 12mol/L,换算成 相应的碘元素，则对应I的浓度依次为0.015,0. 03,0. 045, 0. 06,0. 075,0. 09mol/L,体积均为100 y L，用CT测试仪测得对应CT值HU与Au和I相应浓度的线性关系。从附图8a可以看出，当金的浓度相同时，{(Au°) 12Q-G5. NHAc-DTA-(PEG-FA)-mPEG}的CT值比{(Au0) 120-G5. NHAc-PEG18I有明显增高；而当碘的浓度相同时(见附图8b)，{(Au0) 120-G5.NHAc-DTA30- (PEG-FA) 6_mPEG9}比欧乃派克更是有更大的CT值，而且随着有效成像元素浓度的增加，CT值均呈现很好的线性增大关系。这充分证明本发明所制备的双元素CT靶向造影齐IK (Au0) 120-G5. NHAc-DTA30- (PEG-FA) 6-mPEG9}DSNPs确实具有更强的X-射线衰减强度和更好的成像效果。实施例6将一定量的不同浓度的材料加入到培养基中与KB细胞共培养，通过MTT测试来考察该材料对细胞活力的影响(附图9)。用PBS缓冲液配制样品浓度依次为0. 05 ii M，0. I ii M,0. 2 u M, 0. 3 u M, 0. 5 u M, L 0 u M, L 5 u M, 2. 0 u M, 3. 0 u M,分别与 KB 细胞在 370C >5% 的 CO2培养箱中共培养24h，然后加MTT继续培养4h，之后取出加DMS0，置于摇床内l(T20min，然后用酶标仪测试结果。结果表明，当样品浓度达到2. 0 y M时，材料对细胞活力仍然未表现出明显的影响，说明本发明制备的{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3q-(PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs在给定浓度范围内具有良好的生物相容性。实施例7配制不同浓度的{(Au0)120-G5. NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6iPEG9} DSNPs 的 PBS 溶液(分别为IOOnM, 300nM, 500nM, IOOOnM, 2000nM)，然后用上述不同浓度的材料与KB细胞进行共培养(对照组未添加材料，只加入等量的PBS溶液)，在37°C、5%的CO2培养箱中培养24h后，用相差显微镜观察不同浓度材料对细胞的形貌影响(附图10)。从图中照片可以看出，当材料浓度达到2000nM时，细胞形貌仍然良好，未表现出明显的形貌变化，这说明所制备的{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs在给定浓度范围内对细胞生长无影响。实施例8采用6孔板种植高叶酸受体表达的KB细胞，每孔种植细胞数为200万，然后置于37 °C、5%的CO2培养箱中培养24h，待用。用PBS配制{(Au°) 12(I-G5.NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6-mPEG9}的浓度依次为 0，500，1000，1500，2000nM。用 PBS 缓冲液配置相同浓度梯度的不含FA的{(Au°) 12(I-G5. NHAc-mPEG18}溶液作为对照。将上述不同浓度的材料依次加入提前一天种好的KB细胞培养板中，每孔加入材料体积为200 u L,培养液体积为
I.8mL,共培养3h后，将上述两组细胞用PBS缓冲液清洗，并进行消化处理。然后通过体外CT扫描的方法测试细胞经不同材料处理后的CT成像效果，结果如附图11所示，含靶向分子FA的纳米颗粒处理后的细胞的CT值在材料浓度达到IOOOnM以后普遍高于未连接靶向分子的对照组。这说明通过连接靶向分子FA，确实能够使双元素靶向CT造影剂{(AU°)12CI-G5.NHAc-DTA3O- (PEG-FA) 6-mPEG9} DSNPs的癌细胞靶向性明显增加。对比例I实施例5与实施例8中所用的对比材料{(Au0) 120-G5. NHAc-PEG18I是通过如下方法制备的首先采用与实施例I相同的方法，通过逐次还原氯金酸得到{(Au°)12CI-G5.NHJ纳米粒子，无需透析，在水相体系由EDC和NHS的活化作用直接将mPEG-COOH连接到{(Au°)120-G5. NHJ上，最后在三乙胺存在下用乙酸酐将树状大分子表面剩余的所有氨基全 部乙酰化，透析3d (先用PBS透析Id, 3次，41/次，再用去离子水透析ld，3次，41/次)，冻干后即得到{(Au°) 12Q-G5. NHAc-PEG18}。其核磁谱图如下图13所示。
权利要求
1.一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，包括 (1)将氯金酸水溶液加入到末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2水溶液中，搅拌后加入NaBH4还原，持续搅拌30min后分别加入HCl水溶液和NaOH水溶液以调节溶液的PH为中性； (2)将步骤(I)得到的溶液继续重复步骤(I)所述的操作3次，最后分别用PBS和去离子水透析，得到Au NPs水溶液； (3)将泛影酸DTA、l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐EDC HCl和N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS分别溶解在DMSO中，然后将EDC -HCl的DMSO溶液加入到DTA的DMSO溶液中搅拌2h，再加入NHS的DMSO溶液继续搅拌2h，得到活化好的DTA溶液；将所述的活化好的DTA溶液逐滴滴加到步骤(2)得到的Au NPs水溶液中，持续搅拌反应3d，然后依次用PBS和去离子水透析，得到{(Au°) 12(i-G5. NH2-DTA}的纳米复合物； (4 )将EDC HCl和NHS溶解于水中，在水相体系中分别活化FA-PEG-C00H和mPEG_C00H，然后将活化后的FA-PEG-C00H加入到步骤(3)得到的{(Au0) 120-G5. NH2-DTAj的水溶液中，反应3天，再加入活化后的mPEG-COOH，反应3天，之后在三乙胺存在下用乙酸酐将树状大分子表面剩余的氨基全部乙酰化，最后分别用PBS和去离子水透析，冷冻干燥透析液，即得{(Au0) 120-G5. NHAc-DTA- (PEG-FA) -mPEG} DSNPs。
2.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子水溶液中G5. NH2的浓度为I I. 5mg/mL。
3.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)中的所述的各原料之间的摩尔比为G5. NH2 = HAuCl4:NaBH4:HCI:NaOH=I:30:150:150:150o
4.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的氯金酸水溶液的浓度为30mg/mL。
5.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的HCl水溶液和NaOH水溶液的浓度均为0. 3mol/L。
6.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的泛影酸、I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和G5. NH2的摩尔比为200:1000:1000:1.。
7.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的活化好的DTA溶液中DMSO与Au NPs水溶液中水的体积比为1:4。
8.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的透析为先用pH值为7.4的PBS透析一天，再用去离子水透析一天。
9.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的 FA-PEG-C00H、mPEG-COOH 与{(Au°) 12(I-G5. NH2_DTA}的摩尔比为10:10:1。
10.根据权利要求I所述的一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的整个反应在水相体系中进行 。
全文摘要
本发明涉及一种泛影酸修饰的包含金和碘的双元素靶向CT造影剂的制备方法，包括(1)以第五代聚酰胺-胺树状大分子为模版，采用逐步还原法负载更高含量的金纳米颗粒，形成Au NPs；(2)将含碘小分子泛影酸通过EDC活化作用连接到树状大分子表面氨基上，得到同时含有金和碘的纳米复合物；(3)将羧基化的聚乙二醇-叶酸和聚乙二醇单甲醚通过EDC活化作用依次连接到(2)的纳米复合物表面，最后在三乙胺存在下用乙酸酐将树状大分子表面剩余的氨基全部乙酰化，透析并冷冻干燥，即可。本发明的操作简便，条件温和，易于操作；本发明的靶向CT造影剂成像效果好，且具有良好的水溶性和生物相容性。
文档编号C08G81/00GK102698295SQ20121017961
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者史向阳, 彭琛, 肖婷婷 申请人:东华大学