专利名称：一种提取黑海参糖胺聚糖的方法
技术领域：
本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，具体涉及一种提取黑海参糖胺聚糖的方法。
背景技术：
随着人口老龄化程度的提高，心脑血管疾病已经成为人类健康的最大威胁。据报道心脑血管疾病是老年人的三大主要死亡原因之一，目前因心脑血管疾病死亡者占总死亡人数的34%，在存活中约有3/4左右的患者有不同程度的劳动能力和生活自理能力的丧失。而缺血性中风是心脑血管中最常见的一种疾病，占脑血管病的43飞5%，该疾病发病率高、病死率高、致残率高、复发率高，严重的危害着人类生存和生活质量。中风病世界人口标化发病率为239. 4/10万，其中缺血性中风占53. 6%。随着人口老龄化和人类生活方式的变化，其发病率还有逐年增长的趋势。心脑血管疾病已成为人类死亡的头等原因，因此积极开展预防该疾病的药物研制和开发迫在眉睫。海洋是一个巨大的天然产物宝库，丰富的海洋生物和海洋活性物质为我们提供一个巨大的海洋药物资源库。特殊的海洋生态环境与生物链之间的密切相关性使得海洋生物次生代谢产物具有与陆生生物所不同的化学结构和特异高效的生物活性，因此对海洋生物多糖的开发应用具有重大意义。从海洋活性多糖中寻找具有抗凝血作用的有效药物，已引起国内外医药界的密切关注。糖胺聚糖，旧称酸性粘多糖或粘多糖。黑海参糖胺聚糖具有抗凝、纤溶、降低血粘度、调节血脂等活性，作用于缺血性中风(脑梗死)的各个环节，从而达到治疗缺血性中风的目的。糖胺聚糖是海参中与中风治疗有关的主要药效成分；但是，目前从黑海参中提取的黑海参糖胺聚糖为粗品，不能直 接用于制成注射剂。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种提取黑海参糖胺聚糖的方法，将黑海参糖胺聚糖用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱法纯化，得到纯度较高的黑海参糖胺聚糖。本发明的技术方案为一种提取黑海参糖胺聚糖的方法，包括下列步骤步骤一黑海参预处理；步骤二 碱解黑海参体壁；步骤三双酶酶解黑海参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤六干燥黑海参糖胺聚糖粗糖；步骤七依次用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱纯化黑海参糖胺聚糖；步骤八双氧水脱色；步骤九用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤十干燥黑海参糖胺聚糖精糖。优化的，所述步骤七中凝胶柱纯化的具体步骤为将40g葡聚糖凝胶用3倍体积的双蒸水浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40 60°C下溶解上柱，用蒸馏水洗脱，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。优化的，所述缓冲液采用O. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH为6. O 6. 5。本发明中所述DEAE-52纤维素为二乙氨基乙基纤维素,sephadex g-100凝胶为葡聚糖凝胶，本发明对采用的试剂、材料和仪器没有特殊要求，其均为市售产品，可通过多种商业渠道购得。本发明的有益效果在于建立了一种有效地制备高纯度的黑海参糖胺聚糖的方法，在碱法提取的同时，结合胰蛋白酶和胃蛋白酶的双酶消化处理，即首先采用碱处理黑海参组织，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增强黑海参体壁组织汇总糖胺聚糖的释放。为提高糖胺聚糖的纯度，本发明采用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱法纯化黑海参糖胺聚糖粗糖。本发明的方法能够平衡黑海参糖胺聚糖的得率与纯度的关系，提高了黑海参糖胺聚糖的纯度。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1
本实施例的从黑海参中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步骤步骤一黑海参预处理；步骤二 碱解黑海参体壁；步骤三双酶酶解黑海参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤六干燥黑海参糖胺聚糖粗糖；步骤七依次用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱纯化黑海参糖胺聚糖；步骤八双氧水脱色；步骤九用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤十干燥黑海参糖胺聚糖精糖。 各步骤的具体方法为
步骤一黑海参预处理；迅速用蒸馏水冲洗黑海参，去除黑海参体表粘附的异物，用长形小刀自腹部仅肛门向前解剖鲜参，立即剔除内脏，迅速用双蒸水洗去污物，称量后将黑海参体壁置于洁净的大烧杯中，剪碎黑海参体壁；
步骤二 碱解黑海参体壁往黑海参体壁中加2倍重量的双蒸水，然后加入2mol/L的NaOH,边加边搅拌，使NaOH溶液终浓度为O. 5mol/L, 4°C过夜消化；
步骤三黑海参体壁的双酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸调解PH值至8. 2，加入黑海参体壁质量O. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴过程中充分搅拌，并滴加5 mmol/L的NaOH溶液，维持pH在8. 2 ;然后将酶解液迅速冷却至30°C以下，保持30min后终止反应；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl调解pH值至2之间，再添加黑海参体壁质量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中继续酶解4h，水浴过程中充分搅拌；酶解终止前取酶解液5mL与玻璃试管中，滴加5%的三氯乙酸溶液进行检测，当溶液呈微混浊时，将酶解液迅速冷却至300C以下，保持30min终止酶解反应；然后以5000r/min离心15min收集上清夜；
步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸处理双酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量为酶解液的10%，逐步添加，边加边搅拌，使酶解液变混浊为止；将溶液保存在冷藏室中静置12h，然后以5000r/min离心25min收集上清夜；步骤五乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液调解上清液的pH值至
6.8，7000r/min离心lOmin，收集上清加入无水乙醇，边加边搅拌，使乙醇终浓度为55%，4°C过夜沉淀；
步骤六干燥黑海参糖胺聚糖粗糖7000r/min离心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗涤3次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；使沉淀物种的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到粗制黑海参糖胺聚糖；
步骤七
首先将50g 二乙氨基乙基纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡df30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。然后将40g sephadex g_100凝胶用3倍体积的双蒸水浸泡过夜,脱气后装柱,用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg上述浓缩物用IOmL缓冲液在40°C下溶解上柱，用蒸馏水洗脱，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩，得到黑海参糖胺聚糖精糖。所述缓冲液采用O. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH为6. O。步骤八黑海参糖胺聚糖脱色将浓缩物再次充分溶解于双蒸水中，用2mol/LNaOH调解PH至9. O, 50°C保温，逐步加入30%的双氧水进行多糖的脱色处理，溶液接近白色时终止脱色；将溶液冷却至室温，然后于4°C静置2h ;3600r/min离心15min去沉淀，转移上清液至新离心管中冷却至(TC，回调上清液pH为2. 0，再次3600r/min离心15min，去除少量沉淀；` 步骤九用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；将上层清夜转移至新离心管中，加入乙酸钾至其终浓度为2mol/L,充分混勻，4°C过夜沉淀,然后7000r/min离心IOmin,收集沉淀；步骤十干燥黑海参糖胺聚糖精糖
将沉淀物分别用80%、95%、100%乙醇洗涤I次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到的白色干燥无定型粉末即为精制多糖。实施例2
本实施例的从黑海参中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步骤步骤一黑海参预处理；步骤二 碱解黑海参体壁；步骤三双酶酶解黑海参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤六干燥黑海参糖胺聚糖粗糖；步骤七依次用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱纯化黑海参糖胺聚糖；步骤八双氧水脱色；步骤九用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤十干燥黑海参糖胺聚糖精糖。各步骤的具体方法为
步骤一黑海参预处理；迅速用蒸馏水冲洗黑海参，去除黑海参体表粘附的异物，用长形小刀自腹部仅肛门向前解剖鲜参，立即剔除内脏，迅速用双蒸水洗去污物，称量后将黑海参体壁置于洁净的大烧杯中，剪碎黑海参体壁；
步骤二 碱解黑海参体壁往黑海参体壁中加2倍重量的双蒸水，然后加入2mol/L的NaOH,边加边搅拌，使NaOH溶液终浓度为O. 5mol/L, 4°C过夜消化；步骤三黑海参体壁的双酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸调解PH值至9. O，加入黑海参体壁质量O. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴过程中充分搅拌，并滴加5 mmol/L的NaOH溶液，维持pH在9. O ;然后将酶解液迅速冷却至30°C以下，保持30min后终止反应；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl调解pH值至2. 5之间，再添加黑海参体壁质量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中继续酶解4h，水浴过程中充分搅拌；酶解终止前取酶解液5mL与玻璃试管中，滴加5%的三氯乙酸溶液进行检测，当溶液呈微混浊时，将酶解液迅速冷却至300C以下，保持30min终止酶解反应；然后以5000r/min离心15min收集上清夜；
步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸处理双酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量为酶解液的10%，逐步添加，边加边搅拌，使酶解液变混浊为止；将溶液保存在冷藏室中静置12h，然后以5000r/min离心25min收集上清夜；
步骤五乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液调解上清液的pH值至
7.2，7000r/min离心lOmin，收集上清加入无水乙醇，边加边搅拌，使乙醇终浓度为55%，4°C过夜沉淀；
步骤六干燥黑海参糖胺聚糖粗糖7000r/min离心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗涤3次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；使沉淀物种的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到粗制黑海参糖胺聚糖；
步骤七首先将50g 二乙氨基乙基纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。然后将40g sephadex g_100凝胶用3倍体积的双蒸水浸泡过夜,脱气后装柱,用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg上述浓缩物用IOmL缓冲液在40°C下溶解上柱，用蒸馏水洗脱，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩，得到黑海参糖胺聚糖精糖。所述缓冲液采用O. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH为6. O。步骤八黑海参糖胺聚糖脱色将浓缩物再次充分溶解于双蒸水中，用2mol/LNaOH调解PH至9. O, 50°C保温，逐步加入30%的双氧水进行多糖的脱色处理，溶液接近白色时终止脱色；将溶液冷却至室温，然后于4°C静置2h ;3600r/min离心15min去沉淀，转移上清液至新离心管中冷却至(TC，回调上清液pH为2. 0，再次3600r/min离心15min，去除少量沉淀；
步骤九用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；将上层清夜转移至新离心管中，加入乙酸钾至其终浓度为2mol/L,充分混勻，4°C过夜沉淀,然后7000r/min离心IOmin,收集沉淀；步骤十干燥黑海参糖胺聚糖精糖
将沉淀物分别用80%、95%、100%乙醇洗涤I次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到的白色干燥无定型粉末即为精制多糖。本发明实施例中所实施的从黑海参中提取糖胺聚糖的方法，均能够平衡黑海参糖胺聚糖得率与纯度的关系，提高黑海参糖胺聚糖的纯度。
权利要求
1.一种提取黑海参糖胺聚糖的方法，其特征在于包括下列步骤步骤一黑海参预处理；步骤二 碱解黑海参体壁；步骤三双酶酶解黑海参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤六干燥黑海参糖胺聚糖粗糖；步骤七依次用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱纯化黑海参糖胺聚糖；步骤八双氧水脱色；步骤九用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤十干燥黑海参糖胺聚糖精糖。
2.根据权利要求1所述的一种提取黑海参糖胺聚糖的方法，其特征在于所述步骤七中凝胶柱纯化的具体步骤为将40g葡聚糖凝胶用3倍体积的双蒸水浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40 60°C下溶解上柱，用蒸馏水洗脱，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。
3.根据权利要求2所述的一种提取黑海参糖胺聚糖的方法，其特征在于所述缓冲液采用 O. 5mol/L 的 NaAC/HAC,其 pH 为 6. O 6. 5。
全文摘要
本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，具体涉及一种提取黑海参糖胺聚糖的方法。其包括下列步骤步骤一黑海参预处理；步骤二碱解黑海参体壁；步骤三双酶酶解黑海参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤六干燥黑海参糖胺聚糖粗糖；步骤七依次用纤维素离子交换柱层析法和凝胶柱纯化黑海参糖胺聚糖；步骤八双氧水脱色；步骤九用乙酸钾沉淀黑海参糖胺聚糖；步骤十干燥黑海参糖胺聚糖精糖。本发明能够平衡黑海参糖胺聚糖得率与纯度的关系，提高黑海参糖胺聚糖的纯度。
文档编号C08B37/00GK103044565SQ20121058629
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者辛永宁, 林中华, 宣世英, 姜相君, 姜曼, 李雪洁 申请人:青岛市市立医院