一种用于修复角膜的组织工程支架材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于修复角膜的组织工程支架材料及其制备方法和用途。所述支架材料含有：一隐形眼镜；和一生物可降解聚电解质；所述生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜之上。所述支架材料可用于构建组织工程角膜移植物。
【专利说明】一种用于修复角膜的组织工程支架材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种组织工程支架材料领域，尤其涉及一种用于修复角膜的组织工程支架材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]由于疾病或创伤导致的角膜组织受损或缺失是一种临床常见的疾病。角膜组织内无血管，无法自我修复。炎症的角膜疾病甚至可能致盲。现在一般采用角膜移植的方法，但是由于角膜供体的严重不足，导致许多患者不能接受角膜移植手术。同时，同种异体角膜移植可能存在术后免疫及供体排斥。
[0003]组织工程技术的飞跃式发展为角膜的修复带来了一种新的方法。通过提取患者的角膜上皮细胞或口腔黏膜细胞可体外重建角膜后进行移植。但是角膜组织基质成分少，主要以细胞为主，力学性能差，使得直接移植人工重建角膜受限。
[0004]因此本领域急需提供一种更佳的人工角膜重建方法以满足角膜修复的临床应用。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种用于修复角膜的组织工程支架材料。
[0006]本发明的另一个目的是提供上述支架材料的制备方法。
[0007]本发明的再一个目的是 提供一种角膜移植物。
[0008]在本发明的第一方面，提供了一种用于修复角膜的组织工程支架材料，所述支架材料含有:
[0009]一隐形眼镜；和
[0010]一生物可降解聚电解质；
[0011]所述生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜之上。
[0012]在另一优选例中，所述生物可降解聚电解质采用层层自组装技术涂覆于隐形眼镜镜片表面；所述生物可降解聚电解质选自具有优良生物相容性的天然或合成高分子材料，包括胶原(collagen)、明胶(gelatin)、海藻酸钠、壳聚糖(chitosan)和聚氨基酸。
[0013]在另一优选例中，所述生物可降解聚电解质带相反电荷并交替层层自组装于隐形眼镜片上。
[0014]在另一优选例中，所述支架材料通过以下步骤制备得到:
[0015](i)使隐形眼镜表面带上电荷；和
[0016](ii)使生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜片上，得到如上所述的本发明提供的支架材料。
[0017]在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料的制备方法，所述方法包括步骤:
[0018](i)使隐形眼镜表面带上电荷；和
[0019](ii)使生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜片上，得到如上所述的本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料。
[0020]在另一优选例中，所述方法包括步骤:
[0021](I)将隐形眼镜浸泡于聚乙烯亚胺水溶液中，使隐形眼镜表面带有正电荷；
[0022](2)将表面带有正电荷的隐形眼镜浸泡于pH4.5-6.5的含有带有负电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有一层生物可降解聚电解质的隐形眼镜；
[0023](3)将自组装有生物可降解聚电解质的隐形眼镜浸泡于pH4.5-6.5的带有正电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有两层生物可降解聚电解质的隐形眼镜；和
[0024](4)重复(2)至(3)的步骤I 一 20次，得到如上所述的本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料。
[0025]在另一优选例中，步骤(2)所述带有负电荷的生物可降解聚电解质溶液浓度为
0.lmg/ml至饱和浓度；步骤(3)所述含有带有正电荷的生物可降解聚电解质溶液浓度为
0.lmg/ml至饱和浓度；
[0026]步骤(2)和步骤(3)中所述的浸泡时间为5-30分钟。
[0027]在另一优选例中，在步骤(1)、(2)、和(3)中都包括用ρΗ4.5-6.5的缓冲洗液冲洗未吸附的聚电解质的步骤，并在完成该步骤后进行下一步骤。
[0028]在另一优选例中，所述缓冲洗液的pH值与相应步骤中使用的带电荷的生物可降解聚电解质溶液的PH值相同。
[0029]在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料的用途，用于制备角膜移植物。
[0030]在本发明的第四方面，提供了一种角膜移植物，所述角膜移植物包括:如上所述的本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料；和接种于该支架材料上的角膜上皮细胞或口腔粘膜上皮细胞。
[0031]在另一优选例中，所述角膜上皮细胞或口腔粘膜上皮细胞接种于支架材料的凹面上。
[0032]据此，本发明提供了一种更佳的人工角膜重建方法以满足角膜修复的临床应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1显示了本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料的制备方法示意图。
[0034]图2显示了本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料制备前后的表面形貌；其中A和C显示的是SEM (聚酯膜)制备前，B和D显示的是CS/PLGA制备后的情况；(A, B X 2000 ；D, E X 4000))。
[0035]图3显示了本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料表面接触角变化情况。
[0036]图4显示了本发明提供的用于修复角膜的组织工程支架材料上细胞粘附及增殖情况；其中A和显示的是C聚酯膜，和B显示的是D CS/PLGA制备后的情况；在接种后4(顶部)和24 (底部)小时后。
[0037]图5显示了本发明提供的自组装改性的隐形眼镜修复角膜的情况；其中图5A，C是体外培养2周后戴置于需修复碱烧伤家兔模型眼部的情况，图5B，D是摘除隐形眼镜后完成角膜修复的情况。【具体实施方式】
[0038]发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现利用市售隐形眼镜，在其上自组装生物可降解聚电解质，可以得到一种全新的组织工程支架材料，在该材料上接种种子细胞后所得到的角膜移植物，可以通过佩带隐形眼镜的方式修复角膜。在此基础上，完成了本发明。
[0039]定义
[0040]如本文所用，单数形式“一”、“一个”、“一种”、“该”和“所述”等均包括相关的复数名词，除非在上下文中以别的方式另外强调提出。
[0041 ] 如本文所用，“隐形眼镜(contact lens) ”是一种戴在眼球角膜上，用以矫正视力或保护眼睛的镜片。它包括硬性和软性两种，可以是下述材质，例如硅水凝胶、水合聚合物(甲基丙烯酸甲脂、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸甘油脂等)。由于隐形眼镜是戴在眼球角膜上的，其与眼球接触的一面需与眼球的曲面贴合，在本发明中，将该与眼球接触的一面称为隐形眼镜的凹面。
[0042]如本文所用，“室温”是指20_30°C，优选22-28°C，更优选25±2°C。
[0043]如本文所用，“生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜之上”是指在隐形眼镜片表面构建用于眼角膜修复的组织工程支架材料。
[0044]制备方法
[0045]本发明提供一种用 于修复角膜的组织工程支架材料的制备方法，所述方法是将隐形眼镜进行预处理，使隐形眼镜表面带上电荷后，使生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜上，得到一种用于修复角膜的组织工程支架材料。
[0046]具体地，所述的制备方法包括步骤:
[0047](I)将隐形眼镜浸泡于聚乙烯亚胺水溶液中，使隐形眼镜表面带有正电荷；
[0048](2)将表面带有正电荷的隐形眼镜浸泡于pH4.5-6.5的带有负电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有一层生物可降解聚电解质的隐形眼镜；
[0049](3)将自组装有生物可降解聚电解质的隐形眼镜浸泡于pH4.5-6.5的带有正电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有两层生物可降解聚电解质的隐形眼镜；和
[0050](4)重复步骤(2)至(3) 1- 20次，得到一种用于修复角膜的组织工程支架材料。[0051 ] 上述步骤(2 )中所述带有负电荷的生物可降解聚电解质优选聚氨基酸、海藻酸盐；更优选聚L-谷氨酸。
[0052]上述步骤(3)所述带有正电荷的生物可降解聚电解质选自胶原、明胶、壳聚糖；优选壳聚糖。
[0053]上述步骤(2)和步骤(3)中涉及的含有生物可降解聚电解质的溶液首先需确保能够获得均一的溶液，即生物可降解聚电解质完全溶解，其次所获得的均一溶液的PH值与希望获得的电性的电荷的量有关，可根据具体情况使用本领域熟知的方式调节，PH优选5.5。
[0054]上述步骤(2)和步骤(3)中涉及的含有生物可降解聚电解质溶液浓度以自组装在隐形眼镜上的生物可降解聚电解质是均一溶液为准，一般浓度低的，步骤(4)中的重复次数多，浓度高的，步骤(4)中的重复次数少。例如当浓度为lmg/ml时，步骤(4)中可重复10±1次。一般选择0.lmg/ml至饱和浓度,优选0.5_2mg/ml,更佳地,浓度是lmg/ml。[0055]上述步骤(2)和步骤(3)中涉及的浸泡，其时间以使自组装在隐形眼镜上的生物可降解聚电解质是均一溶液为准，与溶液浓度等相关，例如在浓度为lmg/ml时，浸泡时间为20分钟。
[0056]上述步骤(1)、(2)、和(3)中由于都涉及将电荷负载在隐形眼镜上，因此需要用缓冲洗液冲洗未吸附牢固的带有电荷的物质，为了冲洗干净，可重复冲洗数次。在一优选实施例中，所述缓冲洗液的PH值与相应步骤中使用的含有带电荷的生物可降解聚电解质溶液的PH值相同。所述缓冲洗液所带有的离子越少越好，在一优选实施例中，是盐酸溶液。
[0057]在本发明的一个实施例中，所述用于修复角膜的组织工程支架材料的制备方法包括以下步骤:
[0058]a)隐形眼镜的表面阳离子化
[0059]隐形眼镜的表面阳离子化是将隐形眼镜片室温浸泡于一定浓度的聚乙烯亚胺水溶液中反应数小时，取出隐形眼镜片，用去离子水冲洗干净，再浸泡于一定PH溶液中，取出，用去离子水冲洗干净；
[0060]b)隐形眼镜的层层自组装
[0061]将聚L-谷氨酸(PGA)与壳聚糖(CS)分别在去离子水中配制成一定浓度的溶液，溶解过程中，PGA需在稀NaOH溶液中溶解，CS需在一定浓度的乙酸溶液中，然后调节pH。经表面阳离子化的隐形眼镜浸入到带有负电荷的PGA溶液中，浸泡一段时间，取出，用缓冲洗液将未吸附牢固的PGA冲洗干净，然后浸入到带有正电荷的CS溶液中，浸泡一段时间，取出用缓冲洗液冲洗干净，继续浸泡到PGA溶液中。如此反复浸泡，冲洗若干次，便可在隐形眼镜表面组装得(CS/PGA)n多层自组装聚电解质膜。
[0062]支架材料
[0063]本发明通过上述的制备方法得到一种用于修复角膜的组织工程支架材料，所述支架材料含有:一隐形眼镜；和一生物可降解聚电解质；所述生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜之上；所述生物可降解聚电解质包括可降解性合成高分子材料和天然可降解材料，电荷相反的聚电解质交替自组装于隐形眼镜上。
[0064]本发明提供的支架材料中涉及的生物可降解聚电解质是具有优良生物相容性的天然或合成高分子材料，如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、海藻酸钠、壳聚糖(chitosan)和聚氨基酸等聚电解质。
[0065]角膜移植物
[0066]通过本发明提供的支架材料，经本领域常规的构建组织工程移植物的方法可以得到角膜移植物。
[0067]本发明提供的角膜移植物含有一本发明提供的支架材料和一种子细胞，且以移植物的总体积计，种子细胞的含量为IX IO5个细胞/ml-5X IO8个细胞/ml。
[0068]所述角膜移植物可以通过将种子细胞接种于本发明提供的支架材料上；在一优选实施例中，将种子细胞接种于本发明提供的支架材料的凹面上。所述种子细胞可选自角膜上皮细胞或口腔粘膜上皮细胞。
[0069]本发明提供的组织工程化角膜移植物中，还可添加或复合其他各种细胞因子、生长因子、各种转基因成分。
[0070]本发明提供的角膜移植物体外培养一段时间后戴置于需修复患者眼部，等生物可降解聚电解质完全降解，隐形眼镜与新生角膜逐步脱离，摘除隐形眼镜，完成角膜修复。
[0071]本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0072]本发明的主要优点在于:
[0073]首次采用隐形眼镜作为角膜培养的模具并通过佩戴的方式移植可有效的固定角膜并提供良好的曲度生长环境。
[0074]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按
重量计。
[0075]本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
[0076]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0077]实施例1
[0078]隐形眼镜的表面阳离子化
[0079]将隐形眼镜片室温浸泡于lmg/ml的聚乙烯亚胺水溶液中反应3 — 4小时，取出隐形眼镜片，用去离子水冲洗干净，再浸泡于pH=4.0的盐酸溶液中5min，取出，用去离子水冲洗干净。
[0080]实施例2
[0081]隐形眼镜的层层自组装
[0082]将聚L-谷氨酸(PGA)与壳聚糖(CS)分别在去离子水中配制成lmg/ml的溶液，溶解过程中，PGA需在稀NaOH溶液中(约0.01M)溶解，CS需在1%的乙酸溶液中，然后调节pH=5.5。经表面阳离子化的隐形眼镜浸入到带有负电荷的PGA溶液中，浸泡20min，取出，用缓冲洗液(pH=5.5的水溶液)将未吸附牢固的PGA冲洗干净，然后浸入到带有正电荷的CS溶液中，浸泡20min，取出用缓冲洗液冲洗干净，继续浸泡到PGA溶液中。如此反复浸泡，冲洗若干次，便可在隐形眼镜表面组装得(CS/PGA)多层自组装聚电解质膜。
[0083]实施例3
[0084]隐形眼镜自组装影响材料表面及接触角
[0085]将自组装前后的聚酯膜的表面形貌进行对比。SEM观察结果表明:自组装前的聚酯膜材料表面光滑平整(图2A，C)，而在组装聚电解质材料后，聚酯膜材料的表面呈波浪态(图2B，D)，可明显发现表面带有聚电解质，这说聚酯膜材料成功组装上聚电解质。本发明同时对组装后材料的接触角性能进行了测试(图3)。结果表明，在自组装聚电解质后，材料的接触角明显减小，并且当PLGA为最外层时，材料的接触角比CS为最外层时小。这说明当PLGA为最外层时，组装后材料的亲水性为最好。
[0086]实施例4[0087]自组装隐形眼镜细胞接种与培养
[0088]将人角膜上皮细胞2 X IO5细胞/ml接种于自组装隐形眼镜表面，以未进行自组装聚酯膜材料作为对照。结果显示自组装材料的细胞黏附性能优于聚酯膜材料(图4A，B);且自组装材料对细胞增殖有明显促进作用(图4C，D)。
[0089]实施例5
[0090]自组装改性的隐形眼镜修复角膜
[0091]将自组装改性的隐形眼镜接触眼睛侧接种兔角膜缘干细胞，体外培养2周后戴置于需修复碱烧伤家兔模型眼部(图5A，C)。约2月后聚电解质膜完全降解，隐形眼镜与新生角膜逐步脱离，摘除隐形眼镜，完成角膜修复(图5B，D)。
[0092]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权 利要求范围之中。
【权利要求】
1.一种用于修复角膜的组织工程支架材料，其特征在于，所述支架材料含有: 一隐形眼镜；和 一生物可降解聚电解质； 所述生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜之上。
2.如权利要求1所述的支架材料，其特征在于，所述生物可降解聚电解质采用层层自组装技术涂覆于隐形眼镜镜片表面；所述生物可降解聚电解质选自具有优良生物相容性的天然或合成高分子材料，包括胶原(collagen)、明胶(gelatin)、海藻酸钠、壳聚糖(chitosan)和聚氨基酸。
3.如权利要求2所述的支架材料，其特征在于，所述生物可降解聚电解质带相反电荷并交替层层自组装于隐形眼镜片上。
4.如权利要求1-3任一项所述的支架材料，其特征在于，所述支架材料通过以下步骤制备得到: (i)使隐形眼镜表面带上电荷；和 (?)使生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜片上，得到如权利要求1-3任一项所述的支架材料。
5.一种权利要求1-4任一项所述的用于修复角膜的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (i)使隐形眼镜表面带上电荷；和 (?)使生物可降解聚电解质自组装于隐形眼镜片上，得到如权利要求1-4任一项所述的用于修复角膜的组织工程支架材料。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (1)将隐形眼镜浸泡于聚乙烯亚胺水溶液中，使隐形眼镜表面带有正电荷； (2)将表面带有正电荷的隐形眼镜浸泡于pH4.5-6.5的含有带有负电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有一层生物可降解聚电解质的隐形眼镜； (3)将自组装有生物可降解聚电解质的隐形眼镜浸泡于pH4.5-6.5的带有正电荷的生物可降解聚电解质溶液中，得到自组装有两层生物可降解聚电解质的隐形眼镜；和 (4)重复(2)至(3)的步骤I一 20次，得到如权利要求1-4任一项所述的用于修复角膜的组织工程支架材料。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述带有负电荷的生物可降解聚电解质溶液浓度为0.lmg/ml至饱和浓度；步骤(3)所述含有带有正电荷的生物可降解聚电解质溶液浓度为0.lmg/ml至饱和浓度； 步骤(2)和步骤(3)中所述的浸泡时间为5-30分钟。
8.如权利要求6或7任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)、(2)、和(3)中都包括用PH4.5-6.5的缓冲洗液冲洗未吸附的聚电解质的步骤，并在完成该步骤后进行下一步骤。
9.一种权利要求1-4任一项所述的用于修复角膜的组织工程支架材料的用途，用于制备角膜移植物。
10.一种角膜移植物,其特征在于,所述角膜移植物包括: 如权利要求1-4任一项所述的用于修复角膜的组织工程支架材料；和接种于该支架材料上的角膜上皮细胞或口腔粘膜上皮细胞。
【文档编号】C08J7/04GK103933618SQ201310029490
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月23日 优先权日:2013年1月23日
【发明者】宦金星, 曹斌, 崔磊, 戴建英 申请人:杭州万明生物科技有限公司