专利名称：一种双酶复配生产γ-环糊精的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双酶复配生产Y-环糊精的生产工艺，属于环糊精生产技术领域。
背景技术：
环糊精(Cyclodextrins,通常简称为⑶s),是一类由淀粉或其衍生物在环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用下生成的环状化合物的总称。CDs是以D-吡喃型葡萄糖为组成单元，通过α -1，4-糖苷键相连，常见的环糊精由6、7和8个葡萄糖单元构成，分别被称为α-、β-和Υ-环糊精。由于环糊精自身结构的特殊性，它可以包埋许多无机和有机化合物，例如作为药物的载体、品质改良剂、稳定剂和吸附剂等，所以在食品、化学、医药、农业环保、生物技术和纺织技术等领域都具有广泛的应用。在三种常见的环糊精中，β_环糊精由于水溶解度最小，所以容易通过分步结晶的方法制得，成本较低，在目前的生产中被大量制备和广泛应用。但其溶解度小也限制了它在多种包合作用方面的应用。α-、Υ-环糊精具有很好的水溶性，但是由于现有CGTase生产α -环糊精时转化率低，产物特异性差，且α -环糊精的溶解度相对较高，不容易通过浓缩、结晶等的物理方法从反应液中分离纯化出来，因此造成生产成本太高，难以工业大规模应用。Y-环糊精具有更高的溶解度和更大的空腔，能够包合分子量更大的化合物从而增加化合物的有效溶解度，改善化合物的乳化性等性质，且毒性和刺激性很小，安全性高，在食品、医药等领域已显示出巨大的应用潜力。虽然市场对Y-环糊精产品需求量大，但由于Y-环糊精转化效率极低，导致Y-环糊精价格高昂不下，大大限制了它的应用。目前国外也只有Wacker和Cyclolab等少数几家公司小规模地生产Y-环糊精。生产Y-环糊精方法目前只有生物法。生物法生产Y-环糊精的工艺一般是采用淀粉酶对淀粉液化，再加入Y-CGTase进行环化反应制备Y-环糊精。淀粉原料中含有75-85%的支链淀粉，它是高度分支的多糖，结构是每隔17-28个葡萄糖单元就有一个α-1，6_糖苷键，由于Y-CGTase没有水解α-1，6糖苷键的活性，反应容易终止，从而导致生产周期长，淀粉利用率低。异淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)作为一种可以催化水解糖原、支链淀粉以及它们的β_极限糊精中的α-1，6_糖苷支链的脱支酶，主要被用于水解淀粉生产食品添加剂，如麦芽糖，海藻糖和环糊精等。当将异淀粉酶和CGTase两种酶混合一起进行转化时，异淀粉酶能够先切断淀粉中的分支点，进而加速CGTase的环化反应，提高环糊精的转化率；由于提高了淀粉的利用率，还直接降低了生产成本。Ivan Pishtiyski等用普鲁兰酶对马铃薯淀粉脱 枝后再采用酶转化20小时制备环糊精，发现淀粉浓度2.5%转化率达到最高，为65%。Rendleman等报道采用脱支酶(普鲁兰酶和异淀粉酶)对蜡质玉米淀粉脱枝，再加入a-CGTase，15°C反应5天，最终转化率可以达到76%。但这些工艺也存在底物浓度过低和反应周期长等严重问题。未发现关于异淀粉酶与Y-CGTase联合使用来生产Y-环糊精的报道，因为Y-CGTase在偏中性条件下的酶活很低，只有最高酶活的10%左右；而异淀粉酶在碱性条件下酶活很低，甚至失活。Y Nakagawa等报道来源于嗜碱芽胞杆菌(Alkalophilic Bacillus7364)的 Y-CGTase 的突变体 y -CGTase (A223K)的突变体在偏中性条件下的酶活是最高酶活的30% -40%，在此条件下，为其与异淀粉酶复配打下了基础。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种双酶复配生产Y-环糊精的生产工艺，降低了 Y-环糊精的生产成本。为解决上述问题，本发明技术方案为:米用来源于嗜喊芽胞杆菌7364 (Alkalophilic Bacillus7364)的 y-CGTase 的突变体Y-CGTase (A223K)与异淀粉酶复配生产Y _环糊精；按照5_20 %的浓度进行淀粉调浆，在60-90°C条件下保温5-15分钟；再设定温度40-60°C，调pH7.0-8.0后，按照每克淀粉10-100个单位的量加入Y-CGTase和10-100U的异淀粉酶，加入5% (w/v)的有机溶剂后，充分反应6-12小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到Y-环糊精。所述微生物发酵生产Y-CGTase (A223K)的方法为，以自己构建的基因工程菌E.coliBL21 (DE3) /pET24a (+) - y -CGTase (A223K)为出发菌株，在一定培养条件下(纪丽萍，吴丹，吴敬，陈坚.重组大肠杆菌产Y-环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化中国生物工程杂志，2011，31 (10):50-56)，发酵一定时间，经过高速离心，去除菌体，得到含有Y-CGTase的发酵液，上清即为粗酶液。所述的表达异淀粉酶由本实验室重组表达获得(专利申请号:201110459137.x)。所述在60_90°C条件下保温5-15分钟淀粉调浆的目的在于使淀粉颗粒充分溶胀。所述Y-CGTase (A223K)和异淀粉酶的最适反应温度为40_60°C左右，温度会影响酶对底物的催化效率， 从而影响酶的活力，温度过高或过低都会影响酶的作用效果。所述a-、￠-和Y-环糊精的分析采用高效液相色谱法。色谱条件:Waters600HPLC 色谱仪，Waters 自动进样器，色谱柱 ZORBAX NH2 (4.6mmX 150mm),Waters2410示差检测器；流动相(v/v)为75%乙腈水溶液，流速1.0mL/min ;柱温40。。。处理样品时，8000r/min离心15min,弃沉淀，上清液中加入0.1mL a -淀粉酶液作用Ih,
0.45 u m超滤膜过滤后取10 ii L上机分析。所述有机溶剂为环十二酮。环十二酮不仅能与Y-环糊精特异性的形成包络物沉淀从而提高淀粉总的转化率，而且环十二酮价格相对较低，沸点低，可以通过水蒸气蒸馏几乎全部除去，极少残留在最终的产品中。所述回收有机溶剂，通过结晶手段得到Y-环糊精的具体方法为:待反应结束后，将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括未反应的淀粉和有机溶剂与Y-环糊精形成的络合物沉淀；将滤饼用水复溶，然后通过水蒸气蒸馏的方法分离有机溶剂和Y -环糊精，将获得的环糊精的水溶液经过布氏漏斗过滤除掉不溶性淀粉。将水溶液旋转蒸发浓缩，低温放置得到Y-环糊精的结晶。本发明的技术原理如下:y -CGTase除了能与淀粉发生环化反应产生Y -环糊精外，还能发生偶合、歧化和水解反应，偶合反应是环化反应的逆反应。当采用麦芽低聚糖为底物时，底物中存在的葡萄糖等小分子糖会抑制Y-CGTase的环化反应，影响最终收率。本发明直接采用糊化的淀粉来生产环糊精以解除小分子糖对环化反应的抑制，在中温搅拌的条件下，淀粉颗粒充分溶胀，然而淀粉中含有大量的α-1，6-糖苷键，Y-CGTase无法水解a-1，6糖苷键而不能充分利用淀粉原料，此时加入异淀粉酶可水解α-1，6-糖苷键，从而利于环化反应，缩短反应时间，提高Y-⑶的转化率。Y-环糊精可以与有机物形成不溶于水的包络物，当添加一定比例的有机溶剂可以连续地从反应系统中去除环糊精，使反应向着环糊精的生成方向不断进行，有利于环糊精生产，同时解除了 Y -环糊精对Y -CGTase的产物抑制作用。本发明是根据Y-CGTase (Α223Κ)和异淀粉酶以及产物Y-环糊精的特点生产Y-环糊精的工艺，相对于现有技术，具有以下优点:I)提供一种高转化率、低成本的Y-环糊精的生产方法，填补了该技术领域内的空白，为生物法大规模生产Y-环糊精奠定基础；2)本反应总的反应周期短，只需要6-12小时；3)酶反应的温度比较低，不需要进行剧烈的温度变化，低能耗，适合工业化生产；4)直接利用原淀粉作为底物，解除了葡萄糖等小分子糖抑制Y-环糊精的生成的作用；添加一定比例的有机溶剂，连续地从反应系统中去除Y-环糊精，使其向生成Y-环糊精的反应方向不断进行，提闻了 Y _环糊的转化率，总转化率最闻可达到70%左右,其中
Y-环糊精和β -环·糊精的比例约为9:1。5)有机溶剂去除过程方法简单，得到的产品纯度高，杂质少，可达95%左右，有机溶剂残留量可用于医药行业等。总体来讲，本发明具有生产周期短、原料转化率高、产品纯度高、工艺流程简、生产成本低等优点。
具体实施例方式实施例1:基因工程菌的构建及培养根据NCBI 中 Alkalophilic Bacillus7364 中 Y-CGTase 序列，以其 223 位的氨基酸由丙氨酸㈧突变为赖氨酸⑷后的序列为模板设计引物，PCR增后获得，目的片段。将目的片段和载体pET24a双酶切后胶回收，16 °C连接过夜后转入E.coliJM109感受态细胞中，涂布到LB/Kana平板上37°C培养8h，挑取单克隆菌落至LB/Kana液体培养基中，37°C，200rpm培养8h，提取质粒并酶切验证，得到重组表达载体 pET24a(+)-Y-CGTase(A223K)，转入 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌E.coliBL21 (DE3) /pET24a (+) - y -CGTase (A223K)，接种于 TB 培养基中，培养 24_48h，离心后取上清，即为粗酶液。实施例2原料预处理:按照5-20%的浓度进行淀粉调浆，在60-90°C条件下保温5_15分钟，使淀粉颗粒充分吸水溶胀；酶法生产工艺:预处理后将温度设定为40_60°C，调pH7.0_8.0后，按照每克淀粉同时加入10-100个单位的Y-CGTase和10-100U的异淀粉酶，然后加入5% (w/v)的环十二酮后，充分反应6-12h ；
Y-环糊精的提取工艺:沸水浴灭酶后，将反应液过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括环十二酮与Y-环糊精形成的沉淀以及未反应的淀粉；将滤饼重新用水复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去环十二酮，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到Y -环糊精的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到Y-环糊精的结晶。所述α-、和Y-环糊精的分析采用高效液相色谱法。色谱条件:Waters600HPLC 色谱仪，Waters 自动进样器，色谱柱 ZORBAX NH2 (4.6mmX 150mm),Waters2410示差检测器；流动相(v/v)为75%乙腈水溶液，流速1.0mL/min ;柱温40。。。处理样品时，8000r/min离心15min,弃沉淀，上清液中加入0.1mL α -淀粉酶液作用Ih,
0.45 μ m超滤膜过滤后取10 μ L上机分析。结果见表1，淀粉总转化率可达70 %，产品中Y-CD 所占比例为 65.4%, β-CD 占 4.6%，实施例3原料预处理:同实施例2酶法生产工艺:预处理后将温度设定为40_60°C，调ρΗ7.0_8.0后，按照每克淀粉10-100个单位的比例先加入异淀粉酶，反应2-6小时；然后再加入10-100个单位的Y -CGTase和5% (w/v)的环十二酮后，充分反应4-10小时；Y -环糊精的提取工艺及检测方法:
同实施例2淀粉的总转化率高达68.8%，产品中Y-环糊精所占比例为64.3%，β -环糊精占 4.5!%。实施例4原料预处理:同实施例2酶法生产工艺:预处理后将温度设定为40_60°C，调ρΗ7.0_8.0后，按照每克淀粉10-100个单位的比例先加入Y -CGTase和5% (w/v)的环十二酮，反应2_6小时；再加入10-100U的异淀粉酶，充分反应4-10小时；Y -环糊精的提取工艺及检测方法:同实施例2 淀粉的总转化率高达69.7%，产品中Y-环糊精所占比例为65.6%，β -环糊精占 4.1!%。
权利要求
1.一种双酶复配生产Y-环糊精的生产工艺，其特征在于，采用来源于嗜碱芽胞杆菌(Alkalophilic BaciIIusclarkii7364)的 Y-CGTase 的突变体 y -CGTase (A223K)与异淀粉酶复配生产Y-环糊精；按照5-20%的浓度进行淀粉调浆，在60-90°C条件下保温5-15分钟；设定温度40-60°C，调pH7.0-8.0后，按照每克淀粉10-100个单位的量加入Y-CGTase (A223K)和10-100U的异淀粉酶，加入5 % (w/v)的有机溶剂后，充分反应6_12小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到Y-环糊精。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于所述回收有机溶剂、结晶方法为:将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括有机溶剂与Y-环糊精形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去有机溶剂，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到Y-环糊精的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到Y-环糊精的结晶。
3.根据权利要求1或2所述的 生产工艺，其特征在于，所述的有机溶剂为环十二酮。
全文摘要
本发明涉及一种双酶复配生产γ-环糊精的生产工艺，属于环糊精生产技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种双酶复配生产γ-环糊精的工艺，降低了γ-环糊精的生产成本，技术方案为采用来源于嗜碱芽胞杆菌的γ-CGTase(A223K)和异淀粉酶生产γ-环糊精；按照5-20％的浓度进行淀粉调浆，在60-90℃条件下保温5-15分钟；设定温度40-60℃，调pH7.0-8.0后，按照每克淀粉10-100个单位的量加入γ-CGTase(A223K)和10-100U的异淀粉酶，加入5％(w/v)的有机溶剂后，充分反应6-12小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到γ-环糊精。
文档编号C08B37/16GK103074399SQ20131003679
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者吴敬, 王磊, 吴丹, 陈坚 申请人:江南大学