一种利用猪小肠制备肝素钠的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从猪小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法，特别公开了一种利用猪小肠制备肝素钠的方法。该利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：包括如下步骤：肠粘膜的制备、酶解、吸附、洗脱、沉淀脱盐和脱水干燥即得肝素钠。因此，本发明的有益效果是：收率高，肝素钠活性损失小，质量稳定，废液排放无污染且能循环使用，采用车间废气净化处理装置，解决了肝素钠车间气味恶臭的问题：利用旧工艺生产1亿个单位的肝素钠，需要2000-2400根猪小肠，而利用本发明的制备方法生产1亿个单位的肝素钠，只需要1400-1600根猪小肠，且肝素钠效价和洁性都有大幅度提高，从而使生产成本大大降低，利润可提高40％以上。
【专利说明】一种利用猪小肠制备肝素钠的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种用猪小肠制备肝素钠的方法。
【背景技术】
[0002]肝素是一种广泛存在于哺乳动物组织中的黏多糖，主要存在与肥大细胞中，具有抗凝血作用，被广泛用于手术和脑血栓、心肌梗死等的治疗。肝素的分子量大约3000-37500，对商品肝素的研究提示至少有21种分子个体。肝素钠是肝素的钠盐。肝素钠作为天然抗凝血物质受到世界各国的重视。也是我国主要的出口药物之一。随着研究的深入，人们发现肝素钠不但有抗凝、抗血栓形成和调节血脂的作用，还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等功能。目前，肝素钠主要是从猪、羊小肠黏膜和牛肺、盹肠衣盐水等中提取。研究显示肝素钠是在猪小肠粘膜中含量最高。肝素钠粗品是我国的传统出口产品，在国际上占有重要的地位。但是传统生产工艺落后，肝素钠产率低，肝素钠产品质量不稳定，
[0003]生产过程中资源浪费严重，污染环境严重。
【发明内容】
[0004]本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种收率高、肝素钠活性损失小的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法。
[0005]发明是通过如下技术方案实现的:
[0006]一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是:包括如下步骤:
[0007](I)肠粘膜的制备`:在猪小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池；
[0008](2)酶解:用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为1: 7-9，搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9，加热使温度达到550C _60°C，再加入重量百分比为3% -5%的肠衣专用盐，测其盐度达到2% -2.5%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80°C -85°C，保温30-40分钟后，用80目尼龙布过滤，收集过滤液；
[0009](3)吸附:将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58°C _60°C时加入树脂，搅拌8-10小时，继续冷却到40°C -45°C，放出废液，收集过滤树脂；
[0010](4)洗脱:
[0011](4-1):将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中，加入质量分数为5% -7%的盐水，温度保持在50°C -55°C，搅拌30-40分钟；
[0012](4-2):随后将废液倒掉，加入质量分数为20% -24%的盐水，温度保持在500C -55°C，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
[0013](4-3):重复(4-2)的步骤，将两次收集的洗脱液合并待用；
[0014](5)沉淀脱盐:
[0015]将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80% -85%的乙醇，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；[0016](6)脱水干燥:将上述沉淀物滤干脱水，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
[0017]步骤(2)酶解中粘膜与2709碱性蛋白酶的重量比为500: I。
[0018]说明书
[0019]步骤(3)吸附中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30克树脂的比例添加。
[0020]步骤(4-1)中树脂与加入的质量分数为5% -7%盐水的重量比为1: 1.1-1.3，步骤
[0021](4-2)中树脂与加入的质量分数为20% -24%盐水的重量比为I: 1.1-1.3。
[0022]步骤(4-3)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为20% -24%的盐水，温度保持在50°C -55°C，搅拌30-40分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。
[0023]步骤(5)沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。
[0024]步骤(5)沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为1: 1.8-2.2。
[0025]步骤(6)脱水干燥中烘箱的温度为80°C -90°C，干燥时间为6_8小时。
[0026]上述步骤(3)吸附中，所加树脂为德国拜耳树脂；步骤⑷洗脱中，盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。
[0027]为了使粘膜刮制容易，常习惯将小肠浸泡24-48小时，这样能保护肠衣免受破损，但长时间浸泡会发酵产生肝素酶，分解肝素钠，此外发酵还会产生一些有害物质，使树脂中毒，因此在浸泡时间上一定要准确把握，夏季适当缩短时间，冬季可适当延长时间，在弱碱性或质量分数为4%的盐水条件`下，能减缓微生物的发酵和抑制肝素酶活性，可以放于低温处作短期贮存。
[0028]乙醇沉淀时，必须在搅拌的同时逐渐加入乙醇，以避免局部乙醇浓度突然增高，而且乙醇要用预冷过的，否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏，从而降低其活性。
[0029]酶解、吸附肝素钠过程中的废液(煮锅废水)，气味恶臭，致使生产车间空气环境及其混乱，使人难以忍受，甚至影响工作人员的身心健康。为此本发明采用车间废气净化处理装置，大大减少了空气中的恶臭气味，极大改善了工作环境。
[0030]因此，本发明的有益效果是:收率高，肝素钠洁性损失小，质量稳定，废液排放无污染且能循环使用，采用车间废气净化处理装置，解决了肝素钠车间气味恶臭的问题；利用旧工艺生产I亿个单位的肝素钠，需要2000-2400根猪小肠，而利用本发明的制备方法生产I亿个单位的肝素钠，只需要1400-1600根猪小肠，且肝素钠效价和活性都有大幅度提高，从而使生产成本大大降低，
[0031 ] 利润可提闻40%以上。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0033]实施例1:
[0034]利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤:
[0035](I)肠粘膜的制备:
[0036]取400根猪小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净；将肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜420千克；[0037](2)酶解:
[0038]打开粘膜泵，将420千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将3360千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为50r/min，搅拌均匀，再加入840克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为8.0 ;打开蒸汽阀门使温度达到55°C，加入150千克肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.5%，保温2小时；恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到80°C，停止加温，保温30分钟；保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
[0039](3)吸附:
[0040]将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为50r/min，使罐中的温度自然降到58°C，保持溶液的PH值为8.0，盐度2.5% ;将10千克树脂加入吸附罐中，搅拌8小时；自然冷却温度到45°C，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂；
[0041](4)洗脱:
[0042](4-1):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为5%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在50°C，开启搅拌机转速为30r/min，搅拌30分钟；
[0043](4-2):随后将废液倒掉，加入质量分数为22%的盐水，加入盐水的量刚好没过树月旨，温度保持在50°C，开启搅拌机转速30r/min，搅拌3小时后，收集洗脱液；
[0044](4-3):重复(4-2)的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待；
[0045](步骤(4-3)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为22%的盐水，温度保持在500C，开启搅拌机转速30r/min，搅拌30分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；)
[0046](5)沉淀脱盐:`
[0047]将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到40%，调PH值至7.0，搅匀密封沉淀24小时；虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
[0048](6)脱水干燥:
[0049]将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在80°C，蒸汽干燥6小时，烘干即得肝素钠。
[0050]实施例2:
[0051]利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤:
[0052](I)肠粘膜的制备:
[0053]取300根猪小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净；将肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜310千克；
[0054](2)酶解:
[0055]打开粘膜泵，将310千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将2790千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为55r/min，搅拌均匀，再加入620克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为8.0 ;打开蒸汽阀门使温度达到58°C，加入93千克肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.5%，保温2.5小时；恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到82°C，停止加温，保温35分钟；保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
[0056](3)吸附:[0057]将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为55r/min，使罐中的温度自然降到59°C，保持溶液的PH值为7.5，盐度2.5%;将9千克树脂加入吸附罐中，搅拌9小时；自然冷却温度到42°C，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂；
[0058](4)洗脱:
[0059](4-1):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为6%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在52°C，开启搅拌机转速为35r/min,搅拌35分钟；
[0060](4-2):随后将废液倒掉，加入质量分数为20%的盐水，加入盐水的量刚好没过树月旨，温度保持在52°C，开启搅拌机转速35r/mn，搅拌3.5小时后，收集洗脱液；
[0061](4-3):重复(4-2)的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；
[0062](步骤(4-3)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为20%的盐水，温度保持在520C，开启搅拌机转速35r/min，搅拌35分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；)
[0063](5)沉淀脱盐:
[0064]将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为82%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到42%，调PH值至7.5，搅匀密封沉淀23小时；虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
[0065](6)脱水干燥:
[0066]将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在85°C下用蒸汽干燥7小时，烘干即得肝素钠。
[0067]实施例3:
[0068]利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤:
[0069](I)肠粘膜的制备:
[0070]取500根猪小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净；将肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜50千克；
[0071](2)酶解:
[0072]打开粘膜泵，将520千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将3640千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为60r/min，搅拌均匀，再加入1040克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为9.0 ;打开蒸汽阀门使温度达到60°C，入208千克肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.5%，保温3小时；恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温使温度达到85°C，停止加温，保温40分钟；保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
[0073](3)吸附:
[0074]将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为60r/min，使罐中的温度自然降到60°C，保持溶液的PH值为8.0，盐度2.5% ;将10千克树脂加入吸附罐中，搅拌10小时；自然冷却温度到45°C，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂；
[0075](4)洗脱:
[0076](4-1):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为7%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在55°C，开启搅拌机转速为40r/min,搅拌40分钟；[0077](4-2):随后将废液倒掉，加入质量分数为24%的盐水，加入盐水的量刚好没过树月旨，温持在55°C，开启搅拌机转速40r/min，搅拌4小时后，收集洗脱液；
[0078](4-3):重复(4-2)的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；
[0079](步骤(4-3)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为24%的盐水，温度保持在550C，开启搅拌机转速40r/min，搅拌40分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；)
[0080](5)沉淀脱盐:
[0081]将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为85%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到45%，调PH值至8.0，搅匀密封沉淀25小时；虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
[0082](6)脱水干燥:
[0083]将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在90°C蒸汽干燥6小时，烘干即得肝素钠。
[0084]上述步骤(3)吸附中，所加树脂为德国拜耳树脂；步骤⑷洗脱中，盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。``
【权利要求】
1.一种利用猪小肠制备肝素钠的方法，其特征是:包括如下步骤: (1)肠粘膜的制备:在猪小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池； (2)酶解:用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为1: 7-9，搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9，加热使温度达到55 0C -60°C，再加入重量百分比为3% -5%的肠衣专用盐，测其盐度达到2% -2.5%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80°C -85°C，保温30-40分钟后，用80目尼龙布过滤收集过滤液； (3)吸附:将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58°C_60°C时加入树脂，搅拌8-10小时，继续冷却到40°C -45°C，放出废液，收集过滤树脂； (4)洗脱: (4-1):将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中，加入质量分数为5% -7%的盐水温度保持在50°C -55°C，搅拌30-40分钟； (4-2):随后将废液倒掉，加入质量分数为20% -24%的盐水，温度保持在50°C -55°C,搅拌3-4小时后，收集洗脱液； (4-3):重复(4-2)的步骤，将两次收集的洗脱液合并待用； (5)沉淀脱盐: 将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80% -85%的乙醇，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用； (6)脱水干燥:将上述沉淀物滤干脱`水，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是:步骤(2)酶解中粘膜与2709碱性蛋白酶的重量比为500: I。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是:步骤(3)吸附中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30克树脂的比例添加。
4.根据权利要求1所述的制备方法其特征是:步骤(4-1)中树脂与加入的质量分数为5% -7%盐水的重量比为1: 1.1-1.3，步骤(4-2)中树脂与加入的质量分数为20% -24%盐水的重量比为1: 1.1-1.3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是:步骤(4-3)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为20% -24%的盐水，温度保持在50°C -55°C，搅拌30-40分钟后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是:步骤(5)沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是:步骤(5)沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为1: 1.8-2.2。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是:步骤(6)的脱水干燥中烘箱的温度为800C _90°C，干燥时间为6-8小时。
【文档编号】C08B37/10GK103755837SQ201310632804
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】刘乃山, 尚明彩, 迟培升, 夏衬来 申请人:青岛九龙生物医药有限公司