一种蛋白质接枝天然多糖及其制备方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白质接枝天然多糖及其制备方法及用途，具体的涉及一种生物蛋白质接枝壳寡糖及其制备方法与用途，属于天然高分子改性领域。本发明的生物蛋白质接枝壳寡糖是将壳寡糖溶解后，与生物蛋白质溶液在催化剂微生物转谷氨酰胺酶的作用下得到。本发明反应条件温和，工艺简单，反应物质均为天然高分子，绿色环保。制得的水溶性壳寡糖-生物蛋白质共聚物具有良好的成膜性、吸湿保湿性和抗氧化作用。
【专利说明】一种蛋白质接枝天然多糖及其制备方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明属天然高分子改性领域，具体涉及一种蛋白质接枝天然多糖，特别是鱼皮胶原蛋白及其水解产物接枝壳寡糖及其制备方法、用途。
【背景技术】
[0002]蛋白质和多糖是共存于食品乳化体系中最重要的两类生物大分子，是影响食品结构和质构的主要因素。蛋白质因能在液液或气液界面上形成吸附层来降低界面张力而多在胶体体系中充当乳化剂，多糖则由于其良好的增稠和持水特性而常用做稳定剂，由此赋予了体系不同于两者单独存在时的功能表现。共价键结合的蛋白质与多糖形成接枝物，既保留了蛋白质的表面活性又具有多糖的亲水性能，与蛋白质多糖弱相互作用形成的混合物对比，对环境条件具有较高的适应性。
[0003]当蛋白质和多糖位于同一体系时，在适合的温度，pH值，离子强度等条件下，二者之间会通过相互作用而发生交联。这些相互作用分为范德华力，氢键，静电吸引，疏水相互作用及热力学不相容性的次级力等，这都和他们所处的体系息息相关。其中，比较常见的是美拉德(Mailard)反应，这些相互作用得到的产物具备优良的功能特性，比如较高的溶解性、乳化特性等。 [0004]蛋白质的氨基基团与糖的还原性羰基末端经接枝反应可以得到蛋白质-糖共价复合物。这种基于Maillard反应机理的化学改性，由于其不需要任何化学试剂作为催化剂，仅加热即可进行反应，被认为是一种有效改善蛋白质功能特性的绿色方法。研究发现，蛋白质-糖的接枝物对于外部环境因素具有较高的稳定性，与以次级力相结合的蛋白质-糖非共价复合物相比，其结合不受热或PH值的影响。目前，国内外许多学者已对卵清蛋白、蛋清蛋白、牛血清蛋白、β_乳球蛋白、大豆分离蛋白、大米蛋白等蛋白质与糖类化合物的接枝反应进行了深入研究。结果表明，由于亲水性糖链的共价接入，蛋白质分子的乳化性、溶解性、热稳定性、抗氧化性等功能特性均有显著的提高。
[0005]国内外对蛋白质和糖进行接枝改性的传统方法主要有两种:干热法和湿热法。干热法由日本Kato教授首先提出，通过控制自发的美拉德反应来实现，反应是在低于蛋白质变性温度下进行的，而且需控制反应体系的水分活度使蛋白质的氨基处于非聚集的反应状态。干热法接枝反应步骤如下:将蛋白质和糖按照一定的比例溶解于水中，分散均匀后进行冷冻干燥，将冻干粉置于一定温度和相对湿度环境下进行反应。干热法多用于多糖和蛋白质的接枝反应，接枝物功能特性较好，但反应时间较长，另外对反应条件的要求较为严格。湿热法通常是将蛋白质和糖按照一定的比例溶解于选定PH值的缓冲溶液中，然后放在一密闭的容器里，使用水浴或者油浴来进行反应。PH值和温度对湿热法接枝反应的速度影响较大，缓冲溶液越呈碱性，温度越高，体系反应速度越快。与干热法相比，湿热法制备蛋白质-糖接枝产物所需时间较短，一般需要几到十几小时的反应时间，但高温下易发生蛋白质肽链的变性和聚集，加速Maillard反应向高级阶段进行，不利于控制反应朝有利的方向发展，多被用于蛋白质与小分子糖之间的接枝反应。[0006]近年来，积极寻找有效的蛋白质-糖接枝反应的方法，成为国内外研究小组的热门课题。管军军研究了微波辐射加热方式对大豆分离蛋白-多糖接枝反应的影响，发现微波加热能够显著促进大豆分离蛋白与乳糖、可溶性淀粉之间的接枝反应，且其共价复合物的功能特性较大豆分离蛋白相比有显著的提高。齐军茹通过加入极性有机溶剂降低反应体系的水分活度，建立了液相体系中大豆酸沉蛋白-葡聚糖之间的Maillard反应模型，产物的功能性质与干热反应的蛋白质-多糖复合物所表现出来的优越功能性质相当。王金水使用超声波处理技术促进了小麦蛋白与阿拉伯胶、麦芽糊精在水溶液中的接枝反应，接枝物的溶解性和热稳定性得到明显的提高。许彩虹使用高压反应釜装置探讨了大豆7S球蛋白与葡聚糖在压力作用下的接枝反应，在提高接枝程度的同时，低压能够显著抑制反应中的褐变程度，即减少了高级阶段有色物质的生成。管永光将脉冲电场处理技术引入到蛋白质-多糖的接枝反应中，并对其接枝物理化性质和功能性质进行探讨，高强度电场能够显著促进蛋白质-多糖共价复合物的生成，这为低温条件下制备蛋白质-糖接枝物提供了一定参考。
[0007]CN102068965A公开了一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，包括如下步骤:(1)在搅拌下，将壳聚糖的乙酸溶液分散于液体石蜡中，在制孔剂环己烷和少许spanSO存在下，形成壳聚糖微粒；然后在交联剂戊二醛的作用下，壳聚糖微粒进一步交联形成壳聚糖骨架；(2)壳聚糖骨架先进行溶胀处理；然后在DMSO/NaOH混合液中，壳聚糖骨架上的羟基与环氧氯丙烷反应，在壳聚糖骨架上引入环氧基，得到接枝后的壳聚糖骨架；(3)将IDA/NaOH混合 溶液加入接枝后的壳聚糖骨架，20-80°C温度下反应l_10h，抽滤即得所述的壳聚糖分离介质。
[0008]CN101906213A公开了一种新型的蛋白质糖基化接枝方法，包括如下步骤:(1)在拥挤试剂中加入缓冲溶液，搅拌，得到溶液；(2)将蛋白和葡聚糖加入步骤(1)得到的溶液中，搅拌2h后，加入NaN3，在5°C放置24h，再在50_70°C搅拌12_48h后，迅速冷却至低于25 °C，得到糖基化蛋白产物。
[0009]CN101785522A公开了一种植物蛋白与多糖接枝聚合的方法，包括(I)植物蛋白与多糖接枝共聚:将植物蛋白溶解后，加入多糖得到混合溶液，植物蛋白与多糖的质量比为0.1-10:1 ； (2)将混合溶液搅拌2-3小时后，通过频率为500-2000赫兹，15_45kV的脉冲电场，脉冲处理时间为480-2000 μ S，得到共聚物；(3)将共聚物浓缩后喷雾干燥。
[0010]上述现有技术公开的多是植物蛋白与多糖进行接枝，但对于动物蛋白与多糖进行接枝的报道却较为少见，并且，现有技术所述制备方法还存在反应时间长、成本较高、反应中间体有毒副作用等的问题。
[0011]因此，本发明提供了一种新的以转谷氨酰胺酶为催化剂，催化鱼皮胶原蛋白及其水解产物和壳寡糖制备得到蛋白质接枝壳寡糖改性物。在壳寡糖上接入鱼皮胶原蛋白及其水解产物合成具有更高生物活性的生物材料，为鱼皮胶原蛋白及其水解产物的深度开发和应用拓展更大的市场空间。
【发明内容】
[0012]本发明所要解决的技术问题是提供一种催化鱼皮胶原蛋白及其水解产物接枝壳寡糖的制备方法及其用途。[0013]本发明所述天然多糖指的是自然界中广泛存在的纤维素及其衍生物，例如甲壳素类及海藻酸、淀粉等天然高分子材料。本发明优选使用甲壳素类物质壳寡糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术或微波降解技术降解得到的一种聚合度在2~20之间的寡糖，具有水溶性较好和生物活性高，无毒无免疫原性、易被生物体吸收等诸多优良性质，是甲壳素、壳聚糖的升级产品，具有壳聚糖不可比拟的优越性，在生物医药行业得到了广泛的应用。
[0014]本发明所述蛋白质指的是生物蛋白，特别是动物蛋白质，主要来源是禽类、畜类、鱼类和昆虫等。本发明优选使用鱼皮胶原蛋白，是鱼类动物体内含量最丰富的蛋白质，它比牛、猪等哺乳动物来源的胶原蛋白具有更好的生物相容性，并无免疫原性，胶原蛋白有利于细胞的粘着与生长，可促进创伤愈合。
[0015]本发明还优选使用鱼皮胶原蛋白的水解产物明胶和水解胶原蛋白，该两种蛋白质更易被人体直接吸收，还具有独特的吸湿保湿性，外可阻止人体水分过分流失，内可预防自由基对人体细胞的伤害，是修复各种机体组织损伤的重要生物材料。
[0016]本发明解决其技术问题采用以下的技术方案:
本发明提供的生物蛋白质接枝壳聚糖，其特征在于:它是以生物蛋白质和壳寡糖为底物，转谷氨酰胺酶为催化剂制备得到的。
[0017]按上述方案，所述的生物蛋白质选自鱼皮胶原蛋白及其水解产物明胶和水解胶原蛋白。所述的壳寡糖的分子量为1500-2000。
[0018]按上述方案，所述蛋白质接枝壳寡糖，其中壳寡糖的氨基被蛋白质取代的取代度为 0.314-0.721。
[0019]本发明提供的上述蛋白质接枝壳寡糖，其制备方法包括:壳寡糖在磷酸盐缓冲溶液中溶解后，加入预先在相同的磷酸缓冲溶液中溶解的蛋白质，在10-40°C下加入转谷氨酰胺酶催化接枝反应1.0-6.0小时后，再进行后处理。
[0020]按上述反应，所述的蛋白质和壳寡糖的质量比为(0.4-2.0):1.0。
[0021]按上述方案，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为5.0-7.0。
[0022]按上述方案，所述壳寡糖与磷酸缓冲溶液比例为1.0g:(15-30)ml ;蛋白质与磷酸缓冲溶液的比例为(0.4-2.0) g:25 ml。
[0023]按上述反应，所述的转谷氨酰胺酶是粗制转谷氨酰胺酶经超滤膜对酶液浓缩纯化后冷冻干燥制得。
[0024]按上述反应，所述的转谷氨酰胺酶和壳寡糖的质量比为(0.10-0.35):1.0。
[0025]按上述反应，所述的催化接枝反应是在pH为5.0-7.0的条件下反应1.0-6.0小时。
[0026]本发明的有益效果:本发明以转谷氨酰胺酶为催化剂，催化同一生物来源的三种不同蛋白质和壳寡糖合成以酰胺键连接的蛋白质-壳寡糖接枝共聚物，解决了传统采用化学交联剂进行酰胺化反应存在的反应时间长，成本较高，反应中间体有毒副作用的问题。酶催化反应条件温和，环境友好，工艺简单；制得的可溶性蛋白质接枝壳寡糖具有良好的吸湿保湿性、抗氧化性。
[0027] 根据本发明所述生物蛋白质接枝壳寡糖可用于食品、化妆品和医药领域。在绿色食品或功能食品中，为人体同时提供蛋白质与多糖两种机体所需的营养物质与能量来源；在化妆品领域，可作为一种同时具有吸湿保湿性能和抗氧化作用的组分直接应用至护肤品中；在医药领域，则由于本发明所述生物蛋白质接枝壳寡糖具有良好的抗氧化性，可应用于烧伤与烫伤等创伤过程中的恢复过程，预防并减轻由于过氧化而导致的伤口炎症反应。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为实施例2制备的胶原蛋白接枝壳寡糖和壳寡糖的红外图谱；
图2为实施例1-4制备的胶原蛋白接枝壳聚糖对过氧化氢的清除率；
图3为实施例1-4制备的胶原蛋白接枝壳聚糖对DPPH的清除率；
其中，附图2、3中的取代度分别对应相应的实施例，取代度0.314代表实施例1，取代度0.409代表实施例2，取代度0.521代表实施例3，取代度0.686代表实施例4，取代度0.721代表实施例5 ；Vc代表维生素C。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例进一步说明本申请之发明，但实施例不应视作对本发明权利的限定。
[0030]实施例1
鱼皮胶原蛋白接枝壳寡糖，其制备方法如下:
(1)配制pH为5.0的磷酸缓冲溶液，量取15 ml磷酸缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳寡糖，使其充分溶解；另将0.4 g鱼皮胶原蛋白溶解于25 ml磷酸缓冲溶液中；
(2)催化接枝:在步骤(1)所得的壳寡糖溶液中，依次加入步骤(1)所得的鱼皮胶原蛋白缓冲溶液和0.10 g转谷氨酰胺酶，在10°C下磁力搅拌I小时；
(3)后处理:将步骤(2)反应得到的溶液继续升温至100°C，并磁力搅拌10min后，经抽滤，透析三天纯化，冷冻干燥后得到鱼皮胶原蛋白接枝壳寡糖。
[0031]经测定:该鱼皮胶原蛋白接枝壳寡糖中氨基基团被鱼皮胶原蛋白取代的取代度为
0.314。该鱼皮胶原蛋白接枝壳寡糖红外表征的红外图谱见图1，图中:在1654 cnT1和1545CnT1处出现的吸收峰，分别归属于酰胺I带和酰胺II带，说明鱼皮胶原蛋白中酰胺基已成功接枝到壳寡糖的氨基上，得到以酰胺键连接的鱼皮胶原蛋白-壳寡糖共聚物。
[0032]实施例2
水解胶原蛋白接枝壳寡糖，其制备方法如下:
(1)配制pH为6.0的磷酸缓冲溶液，量取20 ml磷酸缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳寡糖，使其充分溶解；另将0.8 g由胶原蛋白经碱性蛋白酶酶解而制得的水解胶原蛋白溶解于25 ml磷酸缓冲溶液中；
(2)催化接枝:在步骤(1)所得的壳寡糖溶液中，依次加入步骤(1)所得的水解胶原蛋白缓冲溶液和0.15g转谷氨酰胺酶，在20°C下磁力搅拌3小时；
(3)后处理:将步骤(2)反应得到的溶液继续升温至100°C，并磁力搅拌10min后，经抽滤，透析三天纯化，冷冻干燥后得到水解胶原蛋白接枝壳寡糖。
[0033]经测定:该水解胶原蛋白接枝壳寡糖中氨基基团被水解胶原蛋白取代的取代度为 0.409。
[0034]实施例3
鱼明胶接枝壳寡糖，其制备方法如下:(I)配制pH为7.0的磷酸缓冲溶液，量取25 ml磷酸缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳寡糖，使其充分溶解；另将1.2g经酸法水解胶原蛋白制得的鱼明胶溶解于25 ml磷酸缓冲溶液中；
(2 )催化接枝:在步骤(1)所得的壳寡糖溶液中，依次加入步骤(1)所得的明胶缓冲溶液和0.20 g转谷氨酰胺酶，在40°C下磁力搅拌6小时；
(3)后处理:将步骤(2)反应得到的溶液继续升温至100°C，并磁力搅拌10 min后，经抽滤，透析三天纯化，冷冻干燥后得到鱼明胶接枝壳寡糖。
[0035]经测定:该鱼鳞胶原蛋白接枝壳聚糖中氨基基团被鱼明胶取代的取代度为0.521。
[0036]实施例4
鱼明胶接枝壳寡糖，其制备方法如下:
(1)配制pH为6.0的磷酸缓冲溶液，量取30 ml醋酸溶液至三口烧瓶中，加入1.0 g壳聚糖，使其充分溶解；另将2.0 g经酸法水解胶原蛋白制得的鱼明胶溶解于30 ml磷酸缓冲溶液中；
(2)催化接枝:在步骤(1)所得的壳寡糖溶液中，依次加入步骤(1)所得的鱼明胶缓冲溶液和0.35 g转谷氨酰胺酶，在30°C下磁力搅拌5.0小时；
(3)后处理:将步骤(2)反应得到的溶液继续升温至100°C，并磁力搅拌10min后，经抽滤，透析三天纯化，冷冻干燥后得到鱼明胶接枝壳寡糖。
[0037]经测定:该鱼明胶接枝壳寡糖中氨基基团被鱼明胶取代的取代度为0.686。
[0038]实施例5
水解胶原蛋白接枝壳寡糖，其制备方法如下:
(1)配制pH为6.0的磷酸缓冲溶液，量取25 ml磷酸缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳寡糖，使其充分溶解；另将2.0 g由胶原蛋白经碱性蛋白酶酶解而制得的水解胶原蛋白溶解于25 ml磷酸缓冲溶液中；
(2)催化接枝:在步骤(1)所得的壳寡糖溶液中，依次加入步骤(1)所得的水解胶原蛋白缓冲溶液和0.3 g转谷氨酰胺酶，在30°C下磁力搅拌4小时；
(3)后处理:将步骤(2)反应得到的溶液继续升温至100°C，并磁力搅拌10min后，经抽滤，透析三天纯化，冷冻干燥后得到水解胶原蛋白接枝壳寡糖。
[0039]经测定:该水解胶原蛋白接枝壳寡糖中氨基基团被水解胶原蛋白取代的取代度为0.721。
[0040]将上述各实施例制备的蛋白质接枝壳寡糖进行如下性能表征:
(I)吸湿性实验:精确称取0.5 g实施例1、2、3制备的蛋白质接枝壳寡糖各两份，分别加入直径3 cm的称量瓶中，将称量瓶分别放置在两个干燥器中，一个干燥器内放有硫酸铵饱和溶液(相对湿度RH=81%)，另一个干燥器内放有饱和碳酸钠溶液(RH=43%)，放置时间为24 h，分别称量样品放置前质量(Wtl)和放置后质量(Wn)。根据下式计算吸湿率:
【权利要求】
1.生物蛋白质接枝壳寡糖，其特征在于:它是以生物蛋白质和壳寡糖为底物，转谷氨酰胺酶为催化剂制备得到的。
2.根据权利要求1所述的生物蛋白质接枝壳寡糖，其特征在于:所述的生物蛋白质选自鱼皮胶原蛋白及其水解产物明胶和水解胶原蛋白，所述的壳寡糖的分子量为1500-2000。
3.根据权利要求1所述的生物蛋白质接枝壳寡糖，其特征在于:所述蛋白质接枝壳寡糖，其中壳寡糖的氨基被蛋白质取代的取代度为0.314-0.721。
4.根据权利要求1或2所述的任意一种蛋白接枝壳寡糖的制备方法，其特征在于:它是先将壳寡糖溶于磷酸盐缓冲溶液中，与蛋白质溶液在转谷氨酰胺酶的作用下，进行接枝反应，并进行后处理。
5.根据权利要求4所述的生物蛋白质接枝天然多糖的制备方法，其特征在于:所述的接枝反应是在PH为5.0-7.0的条件下，将壳寡糖溶液与蛋白质溶液在10-40°C反应1.0-6.0 小时。
6.根据权利要求4所述的蛋白质接枝壳寡糖的制备方法，其特征在于:壳寡糖溶解于pH为5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液中，壳寡糖与磷酸盐缓冲溶液比例为1.0 g:(15-30)ml ;蛋白质溶解于pH为5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液中，蛋白质与磷酸盐缓冲溶液的比例为(0.4-2.0) g:25ml。
7.根据权利要求4所述的蛋白质接枝壳寡糖的制备方法，其特征在于:所述的转谷氨酰胺酶是粗制转谷氨酰胺酶经超滤膜对酶液浓缩纯化后冷冻干燥制得。
8.根据权利要求5所述的蛋白质接枝壳寡糖的制备方法，其特征在于:蛋白质和壳寡糖的质量比为(0.4-2.0):1.0。
9.根据权利要求5所述的蛋白质接枝壳寡糖的制备方法，其特征在于:转谷氨酰胺酶和壳寡糖的质量比为(0.10-0.35):1.0。
10.权利要求1-9中任意一项权利要求所述的蛋白质接枝壳寡糖可以在药品、食品、化妆品领域中起到吸湿保湿及抗氧化的作用。
【文档编号】C08H1/00GK103980500SQ201410163891
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】帅放文, 王向峰, 章家伟 申请人:湖南尔康北山明胶有限公司