一种杏鲍菇下脚料粗多糖及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种杏鲍菇下脚料粗多糖，其是由如下方法制备得到的：粗多糖的提取、乙醇沉淀、透析及干燥。本发明制备的杏鲍菇下脚料粗多糖得率高，蛋白质含量低，同时粗多糖中β-葡聚糖含量大大增加。
【专利说明】一种杏鲍菇下脚料粗多糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明主要涉及食用菌提取领域，具体的说，涉及一种杏鲍菇下脚料粗多糖及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 杏鲍菇（Pleurotus Eryngii)是近年来开发栽培成功的集食用、药用于一体的珍 稀食用菌新品种。现代药理学研究表明，杏鲍菇多糖含量丰富，是主要的活性成分之一，其 在抗血栓、调血脂、调节免疫功能和抗肿瘤、抗放射方面都具有显著的药理作用。
[0003] 杏鲍菇下脚料是菌脚、菇片、菌柄基部等杏鲍菇加工副产物，在加工过程中因难以 食用或商品价值低而被废弃。
[0004] 常规粗多糖提取只是将杏鲍菇下脚料粉碎为粗粉，获得的多糖粗品得率低且多糖 含量低，尤其是普通粉碎很难使胞壁多糖得到大量释放，使多糖粗品中β-葡聚糖含量偏 低。同时，普通粉碎提取多糖蛋白质含量高，但现有的脱蛋白技术较为复杂，且会造成多糖 的损失，不利于规模化生产。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种杏鲍菇下脚料粗多糖及其制备方法，以 克服现有技术中粗多糖提取得率低，粗多糖中β -葡聚糖含量低，难以工业化生产的缺点。
[0006] 本发明首先提供了一种杏鲍菇下脚料粗多糖，其是由如下方法制备得到的：
[0007] 粗多糖的提取：将杏鲍菇下脚料粉碎成纳米级别粉末，沸水提取l_2h得到粗多糖 提取液；
[0008] 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入无水乙醇，至乙醇含量达到70% -80%，室温静置 12_15h，收集沉淀；
[0009] 透析及干燥：将沉淀加水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋透析，将透析后的 溶液冷冻干燥，即得杏鲍菇下脚料粗多糖。
[0010] 具体的说，本发明的杏鲍菇下脚料粗多糖是通过如下方法制备得到的：
[0011] 粗多糖的提取：以杏鲍菇下脚料为原料，粉碎成纳米级别粉末，加入15-20倍重量 的水中，常温浸泡30-60min，加热至沸腾，保持微沸60-120min，9700g离心10-15min ;上清 液减压浓缩至料液比（质量/体积）为1:6-1:7 ;
[0012] 乙醇沉淀：向浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到 70% -80%，室温静置12-15h，离心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0013] 透析及干燥：沉淀加水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋对粗多糖溶液4°C透 析3-4d，将透析后的溶液冷冻干燥，即得杏鲍菇粗多糖。
[0014] 本发明还提供了一种制备杏鲍菇下脚料粗多糖的制备方法，其包括如下步骤：
[0015] 粗多糖的提取：将杏鲍菇下脚料粉碎成纳米级别粉末，沸水提取l-2h得到粗多糖 提取液；
[0016] 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入无水乙醇，至乙醇含量达到70% -80%，室温静置 12-15h，收集沉淀；
[0017] 透析及干燥：将沉淀加水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋透析，将透析后的 溶液冷冻干燥，即得杏鲍菇粗多糖。
[0018] 本发明制备得到的杏鲍菇下脚料粗多糖得率高，超过10%，多糖含量达到 60%以上，蛋白质含量低，同时粗多糖中β-葡聚糖含量大大增加，含量超过30 %。 HPSEC-MALLS-RI分析显示粗多糖主要有三个糖峰，单糖分析结果显示粗多糖主要由葡萄糖 组成，且粗多糖对RAW264.7巨噬细胞株释放Ν0有明显的促进作用。所以本制备方法是一 种简便、高效、成本低、粗多糖得率及含量高、废弃物综合利用的适合规模化生产的方法。
[0019] 本发明通过将杏鲍菇下脚料纳米级粉碎，使胞壁多糖大量释放，从而提高了粗糖 得率，并使多糖含量和β-葡聚糖含量大大增加。同时，粗多糖表现出很好的细胞免疫活 性。
[0020] 因而，利用杏鲍菇下脚料提取杏鲍菇粗多糖，不但原料来源丰富、生产成本低，而 且节约资源、减少环境污染，达到杏鲍菇资源综合利用的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1粗多糖的分子量分布
[0022] 图2粗多糖的单糖组成
[0023] 图3粗多糖促进RAW264. 7巨噬细胞株释放的Ν0量
【具体实施方式】：
[0024] 实施例1 :
[0025] 1、杏鲍菇粗多糖的提取：以杏鲍菇下脚料（杏韩，上海国森生物科技有限公司）为 原料，粉碎成纳米级别粉末（秦皇岛太极环纳米制品有限公司粉碎设备CJM-SY-B，粉碎时 间6h，粒度10-1000nm)，称取10g，加入200mL蒸馏水，常温浸泡60min，加热至沸腾，保持微 沸120min，9700g离心12min。沉淀重复上述步骤，再提取1次，合并上清液。
[0026] 2、多糖粗提液的浓缩：上清液于旋转蒸发仪中减压浓缩至60mL。
[0027] 3、乙醇沉淀：向浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到70%， 室温静置12h，离心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0028] 4、透析及干燥：沉淀加70mL水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋（国药集团 化学试剂有限公司）对粗多糖溶液4°C透析3d，去除小分子物质。将透析好的粗多糖溶液 置于-20°C冰箱中冻存2h，然后再放到-80°C冰箱中冷冻3h，最后放入冷冻干燥机中冷冻干 燥，即得粗多糖干品。
[0029] 制备所得粗多糖得率为12.30%，多糖含量为61.55%，β-葡聚糖含量为 31. 63%。
[0030] 分析天平称量粗多糖干品的重量。按以下公式计算粗多糖得率。
[0031] 粗多糖得率：％) = ^f!f^y.g)xi〇Q% 称取样品重量g)
[0032] 多糖和β -葡聚糖含量的检测：
[0033] 多糖含量测定：用苯酚一硫酸法测定，精密称取本品5mg置2ml离心管中，加蒸馏 水lml，加热助溶后冷却至室温，离心。上清液稀释100倍，精密吸取样品1. 0ml，置15ml试 管中，分别加入苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品 计算样品的糖含量。
[0034] β -葡聚糖含量测定：参照Megazyme公司的酵母和蘑燕β -葡聚糖检测试剂盒中 的方法对多糖样品中β_葡聚糖含量进行测定。
[0035] 实施例2 :
[0036] 1、杏鲍菇粗多糖的提取：以杏鲍菇下脚料（杏韩，上海国森生物科技有限公司）为 原料，粉碎成纳米级别粉末（秦皇岛太极环纳米制品有限公司粉碎设备CJM-SY-B，粉碎时 间6h，粒度10-1000nm)，称取10g，加入150mL蒸馏水，常温浸泡30min，加热至沸腾，保持微 沸120min，9700g离心12min。沉淀重复上述步骤，再提取1次，时间为60min，合并上清液。
[0037] 2、多糖粗提液的浓缩：上清液于旋转蒸发仪中减压浓缩至70mL。
[0038] 3、乙醇沉淀：向浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到75%， 室温静置15h，离心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0039] 4、透析及干燥：沉淀加50mL水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋（国药集团 化学试剂有限公司）对粗多糖溶液4°C透析3d，去除小分子物质。将透析好的粗多糖溶液 置于-20°C冰箱中冻存2h，然后再放到-80°C冰箱中冷冻3h，最后放入冷冻干燥机中冷冻干 燥，即得粗多糖干品。
[0040] 制备所得粗多糖得率为10.97%，多糖含量为67.33 %，β-葡聚糖含量为 35. 60%。
[0041] 实施例3:
[0042] 1、样品制备：称取5mg实施例1制备得到的粗多糖，加入lmLHPLC流动相，充分溶 解，13200r/min离心10min，上清液经0. 25 μ m的水相微孔膜过滤后进行HPSEC-MALLS-RI 分析。
[0043] 2、色谱分析条件：分析柱选TSK PWXL6000和TSK PWXL3000凝胶色谱柱串联后分 析，流动相为含0.05111〇1/1的似托?04和0.15111〇1/1的似勵 3溶液（?!1=7,0.02%叠氮钠）， 流速为0. 5mL/min，色谱柱温用柱温箱恒定在35°C ;激光检测器光源波长选用623. 8nm。多 糖在溶液中的折光指数增量（dn/dc)按照0. 146mL/g计算。
[0044] 3、分子量计算：使用 Astra (version6. 1. 1，Wyatt Technology, Santa Barbara，CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算分子量和其他多糖分子特 性。
[0045] HPSEC-MALLS-RI分析图谱如图1所示。杏鲍菇下脚料经纳米粉粉碎处理后所得粗 多糖组分主要含有3个峰，且分子量分布范围较宽，为25万到500万道尔顿之间。实施例 4 ：
[0046] 1、样品制备：称取实施例2制备得到的粗多糖2mg加入带盖玻璃瓶，加入2mL的 2mol/L的三氟乙酸，110°C油浴4h，冷却至室温，50°C氮吹仪吹干，再加甲醇吹干，重复两次 至无酸味，用2mL超纯水冲洗玻璃瓶于离心管中，13200r/min离心10min，对上清液上高效 阴离子色谱（HPAEC)分析。
[0047] 2、色谱条件：色谱柱 CarboPac?PA20 (3X 150nm);流动相 0· 8% NaOH 溶液（pH = 12);时间 30min ;柱温 30°C ;流速 0· 45mL/min ;进样量 25 μ L。
[0048] 经高效阴离子色谱检测所得单糖组成如图2所示。粗多糖组分经水解后由阿拉 伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖五种单糖组成，其中葡萄糖所占比例最高，达到70%以 上，其次是甘露糖、半乳糖，约为10%，而木糖、阿拉伯糖比例很低。
[0049] 实施例5 :
[0050] 杏鲍菇下脚料粗多糖体外刺激巨噬细胞释放N0的活性测定：
[0051] 1、样品准备：分别精确称取实施例1和实施例2制备得到的杏鲍菇下脚料粗多糖 样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL的样品液。充分溶解后 以15000r/min离心40min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释 成 2mg/ml、0. 5mg/ml 待用。
[0052] 2、细胞培养：取对数生长期的RAW264. 7巨噬细胞株（购自中科院细胞所），用 DMEM完全培养基（Gibco公司）在37°C、含5% C02条件下传代培养，用0. 05%胰酶（Gibco 公司）消化，混悬液l〇〇〇rpm/min离心3min后收集细胞，计数备用。
[0053] 3、试剂配制及标准曲线绘制
[0054] Griess试剂：在烧杯中加入6. 25ml Η3Ρ03，加入蒸馈水250ml，分别加入2. 5g磺胺 (sulfanilamide，Sigma公司）和 0· 25g萘基乙二胺二盐酸盐（naphthyl ethyylenediamine dihydrochloride，Sigma公司），用磁力搅拌器至全部溶解，棕色试剂瓶4°C冰箱保存。
[0055] 标准曲线绘制：配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、 30、35、40 μ Μ共九个；取100 μ L于96孔板孔，加入50 μ L Griess试剂，测定543nm吸光 值，标准曲线每个浓度3个重复，根据吸光值绘制标准曲线。
[0056] 4、样品刺激巨噬细胞释N0量的测定：收集RAW264. 7细胞，用无色RPMI1640(10% 胎牛血清+1 %抗生素液体，Gibco公司）培养基将细胞稀释至5 X 105/mL，加入96孔板，每孔 加入180μ L，然后再加入20μ L待测样品，阳性对照为LPS(1 μ g/mL，Sigma公司），37°C培 养48h。取100 μ L上清于96孔板孔，加入50 μ 1 Griess试剂，室温孵浴10min，测定543nm 吸光值。根据标准曲线计算细胞NO的释放量。
[0057] 结果见附图3,由此结果可以看出，实施例1和实施例2制备得到的杏鲍菇下脚料 粗多糖对RAW264. 7巨噬细胞株释放N0有明显的促进作用，可明显增强巨噬细胞的吞噬杀 伤能力，从而增强机体的抗肿瘤能力。
【权利要求】
1. 一种杏鲍菇下脚料粗多糖的，其特征在于其是由如下方法制备得到的： 粗多糖的提取：将杏鲍菇下脚料粉碎成纳米级别粉末，沸水提取l-2h得到粗多糖提取 液； 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入无水乙醇，至乙醇含量达到70 % -80%，室温静置 12-15h，收集沉淀； 透析及干燥：将沉淀加水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋透析，将透析后的溶液 冷冻干燥，即得杏鲍菇下脚料粗多糖。
2. 根据权利要求1所述的杏鲍菇下脚料粗多糖，其特征在于其是通过如下方法制备得 到的： 粗多糖的提取：以杏鲍菇下脚料为原料，粉碎成纳米级别粉末，加入15-20倍重量的水 中，常温浸泡30-60min，加热至沸腾，保持微沸60-120min，9700g离心10-15min ;;上清液 减压浓缩至料液比（质量/体积）为1:6-1:7 ; 乙醇沉淀：向浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到70% -80%， 室温静置12-15h，离心去除醇沉上清，收集沉淀； 透析及干燥：沉淀加水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋对粗多糖溶液4°C透析 3-4d，将透析后的溶液冷冻干燥，即得杏鲍菇粗多糖。
3. -种制备权利要求1或2所述杏鲍菇下脚料粗多糖的方法，其特征在于其包括如下 步骤： 粗多糖的提取：将杏鲍菇下脚料粉碎成纳米级别粉末，沸水提取l_2h得到粗多糖提取 液； 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入无水乙醇，至乙醇含量达到70% -80%，室温静置 12-15h，收集沉淀； 透析及干燥：将沉淀加水溶解，用截留分子量为3500Da透析袋透析，将透析后的溶液 冷冻干燥，即得杏鲍菇粗多糖。
【文档编号】C08B37/00GK104059161SQ201410293210
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】张劲松, 薛令坤, 刘艳芳, 唐庆九, 周帅, 杨焱, 吴迪, 颜梦秋, 冯娜, 贾薇, 唐传红, 汪雯翰, 冯杰 申请人:上海市农业科学院