一种高得率的灰树花多糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高得率的灰树花多糖的制备方法，通过合适的酶解、醇沉技术、利用聚合物/无机盐双水相体系、大孔吸附树脂除杂、超滤膜进行过滤等步骤来提高灰树花多糖的提取率，将经过本发明提取的灰树花多糖含量与微波辅助萃取得到的灰树花含量进行对比，灰树花多糖含量平均增加18％。
【专利说明】
一种高得率的灰树花多糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食用菌有效成份提取分离【技术领域】，具体而言，涉及高得率的灰树花多糖的制备方法。
【背景技术】
[0002]灰树花其主要活性成份是灰树花蛋白多糖，多糖组份中以葡聚糖为主，以具有β-α —6)分支的β-α —3)葡聚糖为基本结构，含少量的木糖和甘露糖。研究结果表明，灰树花多糖主要通过增强细胞免疫功能而发挥其抗肿瘤作用，在基因水平上，本品有较强的抗化学诱变作用，可用于慢性乙型肝炎及恶性肿瘤放化疗后乏力、白细胞减少、免疫功能降低的综合治疗，并且对艾滋病的预防有一定作用。临床上灰树花多糖口服有效，安全无毒。灰树花多糖具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎的药效。据美国一些癌症专门治疗医院临场实验表明，在化学治疗癌症的同时，用灰树花多糖抑制癌细胞比单纯化疗更见效果。日本医学专家用灰树花多糖进行抗肿瘤体内试验，结果表明，灰树花多糖抑制率可达86.5%，比国际认证的抗癌新药香菇多糖抑制率高出32%。
[0003]灰树花多糖是从优质灰树花子实体中提取的有效活性成分，其气味芳香，功效显著，可做各类保健品、食品的添加原料。
[0004]双水相萃取技术始于20世纪60年代，由于双水相萃取条件温和，容易放大，可连续操作，因此该技术已成功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，也有抗生素，中药有效成份等小分子分离方面的尝试，利用聚合物/无机盐双水相体系来提取灰树花多糖还没见报道。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题是提供一种提取灰树花多糖的方法，通过合适的酶解、醇沉技术、利用聚合物/无机盐双水相体系、大孔吸附树脂除杂、超滤膜进行过滤等步骤来提高灰树花多糖的提取率，为此本发明采用的一个技术方案是:
[0006]一种高得率的灰树花多糖的制备方法，包括以下步骤:
[0007](I)将灰树花子实体晾干至水分含量为10?20%，然后进行粉碎处理，得到200?300目的灰树花粉，与蒸馏水按1:30-50的重量比混合成混合液后，备用；
[0008](2)酶解处理:取占混合液重量0.05-0.2%的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至4-6，振荡或搅拌下于45-55°C酶解30-90分钟；
[0009](3)将灰树花粉进行微波辅助热水提取，所述的微波功率为500-700W，提取时间为3-5分钟；然后继续进行超声波辅助热水提取，其超声温度20-60°C，功率为600-800W，超声时间为20-60min ;然后将所得的灰树花水提液冷却至室温，离心分离得上清液和灰树花残渣，
[0010](4)醇沉多糖:将步骤(3)所得上清液减压浓缩，加入2-4倍体积的无水乙醇进行醇沉后，离心，冷冻高燥后得灰树花粗多糖；
[0011](5)双水相萃取:将灰树花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/无机盐双水相体系中，在温度30-50°C、pH 4-7的条件下震荡30-50分钟，震荡速度为100-200r.mirT1,然后静置20-40分钟分层；所述的聚合物为聚乙二醇，无机盐为磷酸钾；所述的聚乙二醇浓度为10-20%，磷酸钾的浓度15-25% ；
[0012](6)取出富含无机盐的下层，采用大孔吸附树脂以l_4BV/h的流速对所得灰树花粗多糖以3-10倍柱体积水进行洗脱除杂，洗脱流速为0.5-5BV/h，之后，调节pH值范围为6.5-8，采用阴阳离子交换树脂串联树脂柱脱蛋白处理；所述的阴离子交换树脂与阳离子树脂的质量比为1:1?5。
[0013](7)用截留量为8000的超滤膜除盐，截留分子量范围为100000-800000D，
[0014]工作压力为0.5-0.7Mpa，温度为35_50°C，转子的转速为400_600r/min，收集截留浓缩液，并用蒸馏水清洗，合并洗液与浓缩液，干燥，得到灰树花多糖。
[0015]本发明的有益效果是:
[0016]本发明的灰树花粗多糖提取率较高，并且较纯净。
【具体实施方式】
[0017]下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0018]实施例1
[0019](I)将灰树花子实体晾干至水分含量为10%，然后进行粉碎处理，得到300目的灰树花粉，与蒸馏水按1:30的重量比混合成混合液后，备用；
[0020](2)酶解处理:取占混合液重量0.05 %的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至4，振荡或搅拌下于45°C酶解90分钟；
[0021 ] (3)将灰树花粉进行微波辅助热水提取，所述的微波功率为500W，提取时间为5分钟；然后继续进行超声波辅助热水提取，其超声温度20°C，功率为800W，超声时间为20min ；然后将所得的灰树花水提液冷却至室温，离心分离得上清液和灰树花残渣，
[0022](4)醇沉多糖:将步骤(3)所得上清液减压浓缩，加入2倍体积的无水乙醇进行醇沉后，离心，冷冻高燥后得灰树花粗多糖；
[0023](5)双水相萃取:将灰树花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/无机盐双水相体系中，在温度30°C、pH 7的条件下震荡50分钟，震荡速度为200r.mirT1，然后静置20分钟分层；所述的聚合物为聚乙二醇，无机盐为磷酸钾；所述的聚乙二醇浓度为10%，磷酸钾的浓度25% ；
[0024](6)取出富含无机盐的下层，采用大孔吸附树脂以lBV/h的流速对所得灰树花粗多糖以3倍柱体积水进行洗脱除杂，洗脱流速为0.5BV/h，之后，调节pH值范围为6.5，采用阴阳离子交换树脂串联树脂柱脱蛋白处理；所述的阴离子交换树脂与阳离子树脂的质量比为 1:1。
[0025](7)用截留量为8000的超滤膜除盐，截留分子量范围为100000-800000D，
[0026]工作压力为0.5Mpa，温度为35°C，转子的转速为400r/min，收集截留浓缩液，并用蒸馏水清洗，合并洗液与浓缩液，干燥，得到灰树花多糖。
[0027]实施例2
[0028](I)将灰树花子实体晾干至水分含量为15%，然后进行粉碎处理，得到300目的灰树花粉，与蒸馏水按1:30的重量比混合成混合液后，备用；
[0029](2)酶解处理:取占混合液重量0.1 %的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至5，振荡或搅拌下于50°C酶解60分钟；
[0030](3)将灰树花粉进行微波辅助热水提取，所述的微波功率为600W，提取时间为4分钟；然后继续进行超声波辅助热水提取，其超声温度40°C，功率为700W，超声时间为40min ；然后将所得的灰树花水提液冷却至室温，离心分离得上清液和灰树花残渣，
[0031](4)醇沉多糖:将步骤(3)所得上清液减压浓缩，加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉后，离心，冷冻高燥后得灰树花粗多糖；
[0032](5)双水相萃取:将灰树花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/无机盐双水相体系中，在温度40°C、pH为5.5的条件下震荡40分钟，震荡速度为150r 然后静置30分钟分层；所述的聚合物为聚乙二醇，无机盐为磷酸钾；所述的聚乙二醇浓度为15%，磷酸钾的浓度20% ；
[0033](6)取出富含无机盐的下层，采用大孔吸附树脂以3BV/h的流速对所得灰树花粗多糖以6倍柱体积水进行洗脱除杂，洗脱流速为2BV/h，之后，调节pH值为7，采用阴阳离子交换树脂串联树脂柱脱蛋白处理；所述的阴离子交换树脂与阳离子树脂的质量比为1:3。
[0034](7)用截留量为8000的超滤膜除盐，截留分子量范围为100000-800000D，
[0035]工作压力为0.6Mpa，温度为40°C，转子的转速为500r/min，收集截留浓缩液，并用蒸馏水清洗，合并洗液与浓缩液，干燥，得到灰树花多糖。
[0036]实施例3
[0037](I)将灰树花子实体晾干至水分含量为20%，然后进行粉碎处理，得到200目的灰树花粉，与蒸馏水按1:50的重量比混合成混合液后，备用；
[0038](2)酶解处理:取占混合液重量0.2%的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至6，振荡或搅拌下于55°C酶解30分钟；
[0039](3)将灰树花粉进行微波辅助热水提取，所述的微波功率为700W，提取时间为3分钟；然后继续进行超声波辅助热水提取，其超声温度60°C，功率为600W，超声时间为60min ；然后将所得的灰树花水提液冷却至室温，离心分离得上清液和灰树花残渣，
[0040](4)醇沉多糖:将步骤(3)所得上清液减压浓缩，加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉后，离心，冷冻高燥后得灰树花粗多糖；
[0041](5)双水相萃取:将灰树花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/无机盐双水相体系中，在温度50°C、pH 4的条件下震荡50分钟，震荡速度为200r.min-1，然后静置20分钟分层；所述的聚合物为聚乙二醇，无机盐为磷酸钾；所述的聚乙二醇浓度为20%，磷酸钾的浓度15% ;
[0042](6)取出富含无机盐的下层，采用大孔吸附树脂以4BV/h的流速对所得灰树花粗多糖以10倍柱体积水进行洗脱除杂，洗脱流速为5BV/h，之后，调节pH值范围为8，采用阴阳离子交换树脂串联树脂柱脱蛋白处理；所述的阴离子交换树脂与阳离子树脂的质量比为1:5。
[0043](7)用截留量为8000的超滤膜除盐，截留分子量范围为100000-800000D，
[0044]工作压力为0.7Mpa，温度为35°C，转子的转速为600r/min，收集截留浓缩液，并用蒸馏水清洗，合并洗液与浓缩液，干燥，得到灰树花多糖。
[0045]将经过本发明提取的灰树花多糖含量与单纯用微波辅助提取灰树花多糖得到的灰树花多糖含量进行对比，灰树花多糖含量平均增加18%。
[0046]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.一种高得率的灰树花多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将灰树花子实体晾干至水分含量为10?20%，然后进行粉碎处理，得到200?300目的灰树花粉，与蒸馏水按1:30-50的重量比混合成混合液后，备用； (2)酶解处理:取占混合液重量0.05-0.2%的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至.4-6，振荡或搅拌下于45-55°C酶解30-90分钟； (3)将灰树花粉进行微波辅助热水提取，所述的微波功率为500-700W，提取时间为3-5分钟；然后继续进行超声波辅助热水提取，其超声温度20-60°C，功率为600-800W，超声时间为20-60min ;然后将所得的灰树花水提液冷却至室温，离心分离得上清液和灰树花残渣； (4)醇沉多糖:将步骤(3)所得上清液减压浓缩，加入2-4倍体积的无水乙醇进行醇沉后，离心，冷冻高燥后得灰树花粗多糖； (5)双水相萃取:将灰树花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/无机盐双水相体系中，在温度30-50°C、pH 4-7的条件下震荡30-50分钟，震荡速度为100_200r.mirT1，然后静置20-40分钟分层；所述的聚合物为聚乙二醇，无机盐为磷酸钾；所述的聚乙二醇浓度为10-20%，磷酸钾的浓度15-25% ； (6)取出富含无机盐的下层，采用大孔吸附树脂以l_4BV/h的流速对所得灰树花粗多糖以3-10倍柱体积水进行洗脱除杂，洗脱流速为0.5-5BV/h,之后，调节pH值范围为.6.5-8，采用阴阳离子交换树脂串联树脂柱脱蛋白处理；所述的阴离子交换树脂与阳离子树脂的质量比为1:1?5 ; (7)用截留量为8000的超滤膜除盐，截留分子量范围为100000-800000D，工作压力为.0.5-0.7Mpa，温度为35_50°C，转子的转速为400_600r/min，收集截留浓缩液，并用蒸馏水清洗，合并洗液与浓缩液，干燥，得到灰树花多糖。
【文档编号】C08B37/00GK104403014SQ201410632018
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】罗宇 申请人:罗宇