狐狸胆汁中胆汁酸的HPLC分离技术的制作方法

本发明涉及狐狸胆囊胆汁中胆汁酸的分离，以狐狸胆汁为原料利用hplc技术，使狐狸胆囊胆汁中的胆汁酸类物质得以分离。此技术适用于废弃狐胆囊胆汁原料的有效利用。

背景技术：

hplc自20世纪70年代问世以来，经过几十年的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已经趋于成熟，现在已成为最有优势的分离分析方法之一。它采用高压泵及梯度调配器输送流动相，经过色谱柱把样品中各组分进行分离，再结合紫外、荧光、视差等不同检测器，通过计算机自动调控、采集和处理数据，并可对已分离的组分进行收集。动物胆汁中胆汁酸的组成复杂，利用hplc技术可以快速将各组分分离且收集简便。

技术实现要素：

本发明的目的在于使狐胆囊胆汁得到有效利用，应用hplc技术将狐胆汁中胆汁酸类物质快速分离收集。

本发明采用的技术方案是：新鲜狐胆囊胆汁的冻干处理，狐冻干胆粉溶液的制备，hplc技术分离。

本发明提供的一种利用hplc技术对狐胆囊胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：取新鲜狐胆囊胆汁，冷冻干燥制成冻干粉，用甲醇溶解胆汁冻干粉，过滤后备用。用甲醇和磷酸氢盐溶液(ph3～4)作为色谱柱的流动相，对冻干粉溶液中的胆汁酸类物质进行分离，依照保留时间分别收集检测器流出液。

其中，胆汁酸类物质包括牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)。

其中，将新鲜狐胆囊胆汁置入-20℃冰箱中72小时后，用冷冻干燥机真空干燥成冻干粉。

其中，加入甲醇溶解胆汁冻干粉的条件是超声波(功率300w，频率25khz)溶解15分钟。

其中，胆汁冻干粉溶液过滤膜为0.45μm的脂溶性微孔滤膜。

其中，色谱柱为waterssunfiretmc18色谱柱。

其中，磷酸氢盐为k2hpo4和/或kh2po4。

其中，磷酸氢盐溶液摩尔浓度为0.25～0.35m，用无机酸调节ph到3～4。

其中，流动相为甲醇:磷酸氢盐溶液＝80:20，流速为0.9～1.1ml/min。

其中，无机酸为h3po4。

其中，检测器为紫外检测器。

其中，检测器流出的液体顺序依次含牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)。

本发明的方法具有以下优点：

1.首次提供了一种从狐胆囊胆汁中分离获得4种胆汁酸的有效方法；

2.为胆汁酸获得提供了新的原料来源。

3.本方法分离效果稳定，操作简便易掌握。

附图说明

附图1，狐胆囊胆汁的hplc色谱图；

附图2，标准品与狐胆汁的色谱图比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1制备狐胆汁样品溶液

取新鲜狐胆汁100g盛于烧杯内，置于-20℃冰箱中冷冻72小时，用冷冻干燥机真空干燥，最终可获得约2～3g胆汁冻干粉。精密称取冻干粉350mg，溶于50ml甲醇中，超声波溶解10min，0.45μm脂溶性微孔滤膜过滤后备用。

实施例2分离狐胆汁样品溶液

准备超声脱气的流动相，流动相分为a、b两部分，a为色谱纯甲醇，b为0.3mol/l磷酸氢盐溶液(ph＝4)。在205nm紫外检测波长下，将流动相以a:b＝80:20、流速1.1ml/min的色谱系统平衡30min。色谱系统稳定后，进样狐胆汁样品溶液10ul，得到狐胆汁hplc色谱图(见图1)。

实施例3收集分离流出液

样品分离后需注意观察色谱峰信号，检测器可先后检测出8个色谱峰。其中，4号峰为牛磺熊去氧胆酸(tudca)，5号峰为牛磺胆酸(tca)，7号峰为牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)，8号峰为牛磺去氧胆酸(tdca)。因此，需要对以上色谱峰依次分别进行收集。

利用上述方法可获得狐胆汁中已经分离的牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)。

在实施例2的色谱条件下，对上述4种胆汁酸标准品的hplc色谱图和狐胆汁样品的hplc色谱图进行比对(见图2)，由此确定狐胆汁中含有牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺胆酸(tca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种利用高效液相色谱(HPLC)对狐狸胆囊胆汁中胆酸类物质分离的方法。目前尚缺乏有效分离狐胆囊中胆汁酸的方法，本发明提供了一种HPLC技术分离牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)。该方法将新鲜的狐胆囊胆汁制成冻干粉，甲醇溶解，HPLC分离。HPLC技术采用等度洗脱方式，甲醇‑磷酸氢盐溶液(0.25～0.35mol/L，PH＝3～4)为流动相，柱温为15～20℃，流速为0.9～1.1ml/min。本方法填补了目前尚无有效分离狐胆囊中胆汁酸的方法，本方法所采用的色谱条件操作简便易掌握，分离效果稳定，检测信号强、结果准确可靠，可以用于狐胆囊中胆汁酸类物质的分离。

技术研发人员：肖向红;黄金野;张晶钰;柴龙会
受保护的技术使用者：东北林业大学;肖向红;黄金野
技术研发日：2016.03.18
技术公布日：2017.09.26