一种人羊膜间充质干细胞的应用的制作方法

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

据2010年《中国心血管疾病报告》的统计资料显示，我国因各类心脏病需行心脏手术的人数约为750余万，其中冠心病300余万，风心病250余万，先心病200余万，每年新发先心病20万。体外循环(cardiopulmonarybypass,cpb)是心内直视手术必须具备的技术之一。而体外循环术后心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemiareperfusioninjury,miri)引起的一系列并发症仍是导致病死率高的主要原因。

体外循环是指应用人工管道将人体大血管与人工心肺机连接，从静脉系统引出静脉血，并在体外氧合，再经血泵将氧合血输回动脉系统的全过程。体外循环是心内直视手术的一种重要手段,随着体外循环技术、心肌保护措施和心外科手术技巧的不断完善和提高。心内直视手术的并发症逐步下降。

心肌缺血再灌注损伤是临床常见的一种病理生理过程，是组织或器官在供血中断后恢复血供，这不仅没有促进组织或器官功能的恢复，反而加重了其自身功能障碍甚至结构的损伤。目前针对自由基损伤、钙离子超载、能量代谢障碍以及炎性因子等心肌缺血再灌注损伤诱导因素进行干预以及外科医技水平的不断提高，体外循环管理的改进以及术后监护水平的提高，均起到了一定的保护作用，但总体疗效仍然不能达到满意的效果，亟待探寻新的治疗方法。

近年来，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)移植治疗心肌缺血再灌注损伤成为新细胞工程学及替代细胞疗法的研究热点。间充质干细胞也被称为多能间充质基质细胞，属于多能成体干细胞的一种，其具有来源广泛、易体外分离扩增、组织修复能力强等特性，且具有很强的向三个胚层细胞分化的多向分化潜能。间充质干细胞移植治疗潜在的机制主要在以下两个方面：①干细胞可定向归巢至受损心肌部位，在特定的环境中可诱导及分化为该归巢组织的心肌细胞进行修复。②干细胞通过移植到损伤组织或器官，在特定的环境中分泌一些细胞因子，通过旁分泌的机制对组织进行修复。这些细胞因子可抑制炎症因子的趋化，促进创伤愈合及抑制细胞凋亡等。白介素-8(il-8)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)是经典的炎症级联反应中的趋化因子，促使中性粒细胞趋化游离至损伤组织，在心肌缺血再灌注损伤环境中不断积聚、激活,导致炎症反应的恶性循环。白介素-10是公认的抑制单核-巨噬细胞释放炎症因子。最近的研究发现，间充质干细胞通过其强大的旁分泌功能抑制炎性因子如tnf-α、白介素-6(il-6)、il-8等的分泌，有效控制了损伤区域炎症反应，从而减轻急性肺损伤并改善其预后。心肌细胞属于永久性细胞，一旦损伤后很难再修复恢复其功能，心肌缺血再灌注损伤后导致的心肌细胞功能及结构性的衰竭及凋亡是影响术后恢复的主要问题。在对急性心梗的间充质干细胞移植治疗中发现，间充质干细胞可有效改善缺血或梗死区域的心肌细胞活性，延缓心肌凋亡。

人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmesenchymalstemcells，hamscs)作为一种成体干细胞的新来源备受关注。人羊膜间充质干细胞来源于胎盘羊膜组织，与间充质干细胞具有相似的生物学特性，相比其他成体干细胞，人羊膜间充质干细胞具有取材更为方便、几乎不受伦理学限制、增殖能力更强、低免疫原性等优势。目前已有研究发现，人羊膜间充质干细胞可在特性环境下诱导分化为心肌细胞，并凭借其强大的促分泌功能促进生长因子的激活，从而改善缺血环境中的毛细血管密度及流量。目前用于研究和治疗心肌缺血的间充质干细胞主要来源于骨髓和脂肪，但在体外循环心肌再灌注中，未见人羊膜间充质干细胞用于制备相应治疗药物的相关报道。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人羊膜间充质干细胞的应用，即将人羊膜间充质干细胞应用于制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种人羊膜间充质干细胞的应用，是人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。

前述人羊膜间充质干细胞的应用中，人羊膜间充质干细胞是经过传代培养得到的第3～5代人羊膜间充质干细胞，其中90％以上细胞胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，表达cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。

前述人羊膜间充质干细胞的应用中，具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射(股静脉注射)。

前述人羊膜间充质干细胞的应用中，每2～7ml人羊膜间充质干细胞注射液是由人羊膜间充质干细胞1×10⁷～5×10⁸个混悬于生理盐水中制得的。

前述人羊膜间充质干细胞的应用中，人羊膜间充质干细胞的密度为2×10⁶～1×10⁸个/ml。

前述人羊膜间充质干细胞的应用中，人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养。

为了确保本发明方法的科学、合理，发明人进行了相应的实验研究和筛选，才得以确定本发明的技术方案。具体实验内容如下：

一、实验过程

1.1、获取人羊膜

经产妇或家属知情同意后，收集足月剖宫产新鲜胎盘。无菌条件下剥离羊膜，置于含d-hanks无菌瓶中，无菌瓶置于4℃冰盒中，4小时内进入实验流程。产妇产前检查排除乙肝病毒、丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒和梅毒螺旋体病毒感染。

1.2、人羊膜间充质干细胞的分离与原代培养

无菌条件下，用灭菌消毒的d-hanks液冲洗去羊膜上的血块，无菌玻片刮除羊膜上的粘液，剪碎羊膜，装入离心管内。离心管内加入约2倍羊膜体积的0.05％胰蛋白酶-0.02％edta-2na液，置于摇床中震荡，200rpm，37℃震荡消化15分钟，弃去上清液，沉淀重新加入0.05％胰蛋白酶-0.02％edta-2na液。共消化3次，时间分别为15、20和25分钟。最后一次消化后的羊膜组织用d-hanks液冲洗2至3次，转入新的离心管，加入约2倍羊膜体积的0.75mg/mlii型胶原酶-0.075mg/mldnasei液，置于摇床中消化1.5～2h，300目钢网过滤，留取滤液。滤液加入等体积10％fbs的lg-dmem培养基终止消化，2000rpm离心10分钟，弃去上清液，沉淀用含200mmol/ll-谷氨酰胺和3～10％自体脐带血清的低糖-dmem完全培养基悬浮。细胞计数仪计数，分析细胞活力，以2.0×10⁵个细胞/cm²接种于25cm²培养瓶内，37℃，5％co2饱和湿度培养，48小时后弃去培养液，除去未贴壁的细胞，加入新的培养液继续培养。倒置相差显微镜下观察其生长情况。

1.3、人羊膜间充质干细胞传代培养

原代培养的人羊膜间充质干细胞生长融合率至70％～80％左右，弃去培养液，d-pbs液洗涤3次，加入0.125％胰蛋白酶-0.02％edta-2na液1～2ml，37℃消化3分钟，显微镜下观察其消化程度，待细胞回缩、变圆，立即加入等体积10％胎牛血清的低糖-dmem培养基终止消化，1000rpm离心10分钟，弃去上清，细胞沉淀用2～10％自体脐带血清的低糖-dmem完全培养基悬浮，以1.0×10⁵个细胞/cm²接种于25cm²培养瓶内，37℃，5％co2饱和湿度下培养。1.4、人羊膜间充质干细胞鉴定

人羊膜间充质干细胞原代和传代培养过程中，倒置相差显微镜下可见梭形、旋涡状排列的均一的人羊膜间充质干细胞逐渐增多。0.125％胰蛋白酶-0.02％edta-2na液1～2ml，37℃消化第3代人羊膜间充质干细胞，d-pbs液洗涤一次，调整细胞密度为1.5×10⁶个细胞/ml，取细胞悬液100μl按bd公司间充质干细胞鉴定流式细胞术检测试剂盒说明书要求，加入10μl荧光素标记的cd90、cd44、cd73、cd105、cd34、cd45、cd11b和cd19及hla-dr抗体，振荡混匀，设同型对照。室温避光孵育25分钟，每管加入2ml含0.1％牛血清白蛋白的pbs液，振荡混匀，1000rpm离心5分钟，弃上清，振荡混匀细胞。每管加入1％多聚甲醛200μl，震荡混匀，2～8℃避光放置，24小时内上机，facscalibur流式细胞仪检测，cellquest软件进行表型分析。

另取第3～5代人羊膜间充质干细胞制备细胞爬片，用pbs洗涤3次，每次5分钟；4％多聚甲醛室温固定10分钟，pbs洗涤3次，每次5分钟；滴加0.3％triton-x100，室温作用15～20分钟，pbs洗涤一次；加入山羊血清封闭液，室温孵育30分钟；滴加小鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(1:100)，4℃孵育过夜，阴性对照组用pbs替代一抗；pbs漂洗3次，每次5分钟，滴加通用二抗(envision^tmdetectionsystemsperoxidase/dab，rabbit/mouse)，37℃孵育30分钟，pbs漂洗3次，每次5分钟；dab显色3～5分钟，自来水充分冲洗；苏木素复染3分钟，自来水冲洗，干燥后脱水封片拍照，胞浆波形蛋白表达阳性呈现棕色颗粒。1.5、犬体外循环心肌缺血再灌注损伤模型建立和人羊膜间充质干细胞移植

健康杂种犬18只，雌雄不限，体重12.6±2.5kg，由遵义医学院外科动物实验中心提供。杂种犬自由饮食，适应性喂养1周后用于实验，实验前禁食8小时，禁水4小时。

18只健康杂种犬，按随机数字表法随机分为三组：空白组(建立体外循环模型，但主动脉不阻断)、模型组(体外循环+主动脉阻断1小时+主动脉开放后股静脉注射生理盐水)、移植组(体外循环+主动脉阻断1小时+主动脉开放后股静脉注射人羊膜间充质干细胞)，每组6只。

实验前犬禁食8小时，2.5％戊巴比妥钠25mg/kg腹腔注射，麻醉成功后仰卧位固定于手术台上，气管插管建立机械通气(潮气量12ml/kg，呼吸频率15次/分，吸/呼比1∶2，fio2100％)，体表接心电监测电极片，肛门内置入肛温探头。术中间断静脉注射咪达唑仑0.1mg/kg、芬太尼0.01mg/kg和维库溴铵0.1mg/kg维持麻醉。监测ecg、舌粘膜氧饱和度(spo2)、petco2和肛温，右侧股动脉切开插管接动脉换能器监测平均动脉压(map)，右侧股静脉切开插管建立输液通道及监测中心静脉压(cvp)。体外循环前，调节cbw-2型平板变温器，维持循环水温30℃，安装调试好体外循环机及膜式氧合器，预充乳酸钠林格氏液和6％羟乙基淀粉各500ml，预充液内加肝素15mg。胸骨正中劈开，完善止血，切开心包，股静脉内注射肝素3mg/kg，游离右锁骨下动脉，根部做荷包后行动脉插管，右心耳插管(36fr)，连接体外循环管道，主动脉根部缝荷包，插入并固定10号灌注针，连接停跳液灌注装置，待act大于480秒后开始转机，并行5分钟后阻断升主动脉，在灌注针灌注4℃改良st.thomas停跳液10～15ml/kg至心脏完全停跳。转流中维持鼻咽温30℃，流量60～80ml/kg/分钟，平均动脉压(map)55～80mmhg以及氧浓度100％。

主动脉开放后，模型组即刻经股静脉注射生理盐水，实验组则经股静脉缓慢注射含1×10⁷至5×10⁸个细胞的人羊膜间充质干细胞生理盐水混悬液5ml，无菌注射器抽取后，确保无细胞悬液漏出。主动脉开放后，心脏自动复跳，出现室颤者10～20j电击除颤，全程不使用血管活性药物。犬体表面积(bodyareasurface，bas)＝k×w^2/3/10000。其中k为常数11.2，w为体重g，体表面积单位为m²。

1.6、样本收集和心功能、心肌酶学测定

各组动物均于体外循环转流前(t1)、开放主动脉再灌注15分钟(t2)、60分钟(t3)、120分钟(t4)和4小时(t5)五个时间点，采冠状静脉窦血标本8ml，4℃保存，分离血清后严格按试剂盒操作，送遵义医学院附属医院检验科，利用olympus(au2700)全自动生化分析仪，采用氧化酶法，检测乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸激酶同工酶(ck-mb)以及肌钙蛋白i(ctni)浓度；利用酶标仪，通过酶联免疫吸附法(elisa)测定血浆il-8、il-10以及tnf-α含量；同时用md1504导生物信号系统予左室内压波形自动分析，测定心脏血流动力学相关指标。

1.7、心肌组织病理学检查

分别在体外循环前(t1)、主动脉开放后15分钟(t2)、开放后1小时(t3)、开放后2小时(t4)、开放后3小时(t5)五个时间点，用眼科剪分别取左心室心尖部的大小约为0.2×0.2cm²心肌组织，小心避开冠状动脉及其分支小血管。将采集的心肌予以生理盐水冲洗2至3次，于冰袋上用眼科剪将组织分为一大一小两块，大块在室温下用4％甲醛固定3～7天，送遵义医学院附属医院病理科，进行石蜡包埋、切片及he染色后，光镜下观察各组肺组织病理学变化。经脱蜡、水化、抗原封闭、一抗(抗鼠bax、bcl-2和抗人细胞核抗体mab1281)、二抗封闭、显示等步骤，采用tunel染色、dab染色，观察心肌细胞凋亡核数，计算凋亡指数(apoptoticindex)＝阳性凋亡细胞核数/总细胞核数×100％；免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法染色，运用ipp6.0图象分析系统，每组每个时间点取6个标本，每个标本随机选1张切片，每张切片随机选取3个视野拍照，通过图象分析系统测定bax、bcl-2和线粒体融合蛋白2(mfn2蛋白)三种蛋白免疫组化的平均积分光密度(integratedopticaldensity，iod)，检测心肌细胞bax、bcl-2和线粒体融合蛋白2的蛋白表达情况。

1.8、统计学处理

数据以均数±标准差表示，采用spss16.0软件进行统计分析。组内各时间点均数多重比较采用单因素方差分析的lsd检验，方差不齐时用games-howell方法校正；组间比较采用两个独立样本的t检验；比较两组非正态变量时采用spearman相关性分析，率的比较采用χ²检验，p<0.05认为有统计学意义。

二、实验结果

2.1、人羊膜间充质干细胞形态特征

体外培养的人羊膜间充质干细胞呈贴壁生长，原代培养48小时后，可见较多细胞贴壁，细胞形态不一，呈多边形、梭形或星形等(如图1a所示)。细胞传代培养至第3～5代，可见细胞呈纤维样排列紧密，旋涡状生长(如图1b所示)。

2.2、人羊膜间充质干细胞免疫表型鉴定与波形蛋白表达

流式细胞仪检测第3～5代人羊膜间充质干细胞免疫表型，结果显示，人羊膜间充质干细胞均高表达cd44、cd105、cd90、cd73，其中cd44和cd73阳性表达率高达90％以上，不表达cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr(如图2～6所示)。免疫细胞化学染色结果显示，第3～5代人羊膜间充质干细胞胞浆90％以上均表达波形蛋白(如图7所示)。

2.3、体外循环实验犬实验前基本情况监测结果

实验犬的资料被完整的纳入本研究，依据预先设计的实验方案分组；三组实验犬体表面积、体重及参与体外循环(体外循环)总时间等资料无统计学差异(p>0.05，见表1)。各组实验犬体外循环过程中的一般参数均严格按设计的实验方案执行，提示本实验建立的犬体外循环工作模型符合标准，达到实验模型的基本要求。

表1体外循环犬缺血再灌注模型动物各组一般情况监测结果(n＝6)

2.4、体外循环过程中心脏血流动力学的变化

与转流前及对照组比较，在体外循环心肌缺血开放主动脉后，模型组与移植组的左室收缩压(lvsp)和左室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)均存在不同程度降低(p<0.01或p<0.05)，模型组和移植组左室舒张末压(lvedp)均出现不同程度升高(p<0.01或p<0.05)，此后三组的lvsp和±dp/dtmax虽逐渐升高，lvedp逐渐降低，但三组的心脏血流动力学指标在体外循环心肌缺血开放主动脉后4小时时均未能恢复至转流前水平(p<0.01或p<0.05)；与模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组的lvsp及±dp/dtmax下降相对较小(p<0.01或p<0.05)，lvedp增高相对不明显，心功能恢复稍快，持续时间相对较短(p<0.01或p<0.05，见表2)。

表2体外循环犬心肌缺血再灌注过程中心脏血流动力学变化(n＝6)

与转流前比较，^#p<0.05，^##p<0.01；与对照组比较，^*p<0.05，^**p<0.01；与模型组比较，^▲p<0.05，^▲▲p<0.01。

2.5、体外循环犬心肌缺血再灌注损伤过程中血浆心肌酶和肌钙蛋白i的变化

与转流前及对照组比较，在体外循环心肌缺血开放主动脉再灌注之后，模型组与移植组的冠状静脉血浆乳酸脱氢酶浓度，均发生不同程度升高(p<0.01)，随着开放后转流时间延长，模型组与移植组的血浆乳酸脱氢酶水平持续升高，且后二组的血浆乳酸脱氢酶水平均未恢复至转流前水平(p<0.01)；与模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组血浆乳酸脱氢酶水平升高程度相对较小，心肌损伤较轻(p<0.01，表3)。

与转流前及对照组比较，在体外循环心肌缺血开放主动脉之后，模型组与移植组的冠状静脉血浆肌酸激酶同工酶浓度，均发生不同程度升高(p<0.05或p<0.01)，随着开放后转流时间延长，模型组与移植组的血浆肌酸激酶同工酶水平持续升高，且后二组的血浆肌酸激酶同工酶水平均未恢复至转流前水平(p<0.01)；与模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组血浆肌酸激酶同工酶水平升高程度相对较小，心肌损伤较轻(p<0.01，表4)。

与转流前及对照组比较，在体外循环心肌缺血开放主动脉之后，模型组与移植组的冠状静脉血浆肌钙蛋白i浓度，均发生不同程度升高(p<0.05或p<0.01)，随着开放后转流时间延长，模型组与移植组的血浆肌钙蛋白i水平持续升高，且后二组的血浆肌钙蛋白i水平均未恢复至转流前水平(p<0.01)；与模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组血浆肌钙蛋白i水平升高程度相对较小，心肌损伤较轻(p<0.01，表5)。

表3体外循环犬心肌缺血再灌注过程中血浆乳酸脱氢酶浓度的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

表4体外循环犬心肌缺血再灌注过程中血浆肌酸激酶同工酶水平的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

表5体外循环犬心肌缺血再灌注过程中血浆肌钙蛋白i水平的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

2.6、体外循环犬心肌缺血再灌注过程中血浆炎症因子与抗炎因子变化

与转流前及对照组比较，在体外循环心肌缺血开放主动脉之后，模型组与移植组的冠状静脉血浆白介素-8浓度，均发生不同程度升高(p<0.01)，并于主动脉开放后15分钟升高幅度较大，主动脉开放后60分钟逐渐降低，但仍未恢复至转流前及对照组水平(p<0.01)；随着主动脉开放后灌注时间延长，模型组与移植组的静脉血浆白介素-8水平呈逐渐升高趋势且均高于转流前及组ⅰ水平，于开放后4小时达到峰值(p<0.01)；与组模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组血浆白介素-8水平升高程度相对较小，损伤较轻(p<0.01)，局

部炎症反应较弱(表6)。

表6体外循环犬心肌缺血再灌注过程中血浆il-8水平的变化(n＝6)。

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

与转流前及对照组比较，在体外循环心肌缺血开放主动脉之后，模型组与移植组的冠状静脉血浆肿瘤坏死因子-α浓度，均发生不同程度升高(p<0.01)，并于主动脉开放后15分钟升高幅度较大，主动脉开放后60分钟逐渐降低，但仍未恢复至转流前及对照组水平(p<0.01)；随着主动脉开放后灌注时间延长，模型组与移植组的血浆肿瘤坏死因子-α水平呈逐渐升高趋势，且均高于转流前及对照组水平，于开放后4小时达到峰值(p<0.05或p<0.01)；与模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组血浆肿瘤坏死因子-α水平升高程度相对较小，损伤较轻(p<0.05或p<0.01)，局部炎症反应较弱(表7)。

表7体外循环犬心肌缺血再灌注过程中tnf-α含量的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

与转流前及对照组比较，在体外循环心肌缺血开放主动脉之后，模型组与移植组的冠状静脉血浆白介素-10浓度均发生不同程度降低(p<0.01)；后随着开放后转流时间延长，模型组与移植组的血浆白介素-10水平逐渐降低，且该二组的血浆白介素-10水平均低于转流前水平(p<0.01)；与模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组血浆白介素-10水平降低程度相对较大(p<0.01)，白介素-10对损伤心肌炎症抑制作用较明显(表8)。

表8体外循环犬心肌缺血再灌注过程中血浆il-10含量的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

2.7、体外循环犬缺血再灌注心肌组织he染色的病理组织学变化

与对照组相比，模型组心肌细胞出现明显的心肌细胞水肿和空泡变性样改变，心肌肌节结构紊乱，部分区域出现明显心肌断裂、坏死。心肌间质血管损伤充血严重，可见明显炎细胞浸润。在主动脉开放后，移植组病理改变明显轻于模型组，除可见较明显的心肌细胞水肿外，空泡样变性和心肌细胞、肌节断裂和坏死偶见(图8c箭头所示)，炎细胞浸润较少(如图8b箭头所示)。

2.8、体外循环犬缺血再灌注心肌组织心肌细胞凋亡指数变化

与转流前及对照组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，模型组与移植组的心肌细胞凋亡指数均存在不同程度升高(p<0.01)；随着转流时间的延长，该二组的凋亡指数也在不断升高，均未恢复至转流前及对照组水平(p<0.01)；与模型组相比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组的心肌细胞凋亡指数变化低于明显较低(p<0.01)，心肌细胞凋亡程度较轻，移植组可少量见散在的mab1281阳性表达的人来源的人羊膜间充质干细胞的归巢、存活(见表9、图9和图10)。图9中，箭头所指为心肌细胞凋亡细胞核，呈黄色或棕黄色。图10中阳性表达呈棕黄色颗粒(箭头所指处)，为定植于心肌组织的mab1281阳性的人羊膜间充质干细胞。

表9体外循环犬缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡指数的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

2.9、体外循环犬缺血再灌注过程中心肌细胞bax和bcl-2蛋白表达的变化

与转流前及对照组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，模型组与移植组的心肌细胞bax蛋白表达值均存在不同程度升高(p<0.01)；与模型组相比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组的心肌细胞bax蛋白表达量降低(p<0.01)，心肌细胞促凋亡蛋白表达的量相对较少(如表10和图11所示)。在心肌组织中还发现散在的少量细胞核完整的mab1281表达阳性(棕色颗粒)的人羊膜间充质干细胞，表明有少量人羊膜间充质干细胞归巢、存活于心肌组织。图11中，免疫组化染色，bax蛋白阳性表达为黄色、棕黄色或棕褐色(箭头所指处)。

与转流前及对照组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，模型组与移植组的心肌细胞bcl-2蛋白表达值均存在不同程度升高,随着主动脉开放时间的延长而逐渐升高(p<0.01)；与模型组相比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组的心肌细胞bcl-2蛋白表达量明显增高(p<0.01或p<0.05)，心肌细胞抗凋亡蛋白表达量相对较高(如表11和图12所示)。图12中，免疫组化染色，bcl-2蛋白阳性表达为黄色、棕黄色或棕褐色(箭头所指处)。

表10体外循环犬缺血再灌注过程中心肌细胞bax蛋白表达的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

表11体外循环犬缺血再灌注过程中心肌细胞bcl-2蛋白表达的变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

2.10、体外循环犬缺血再灌注过程中心肌细胞线粒体融合蛋白2蛋白表达变化

与转流前及对照组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，模型组与移植组的心肌细胞线粒体融合蛋白2表达于主动脉开放后15分钟升高幅度较大，随着灌注时间的延长，其表达量逐渐减少，但均未恢复至转流前及对照组水平，直至主动脉开放后4小时，线粒体融合蛋白2蛋白表达量达到峰值(p<0.01)；与模型组相比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组的心肌细胞线粒体融合蛋白2变化明显降低(p<0.01)，心肌细胞线粒体功能损伤程度较轻(如表12和图13所示)。图13中，免疫组化染色，线粒体融合蛋白2蛋白阳性表达为黄色、棕黄色或棕褐色(箭头所指处)。

表12体外循环犬缺血再灌注过程中心肌细胞线粒体融合蛋白2的蛋白表达变化(n＝6)

与转流前比较，#p<0.05，##p<0.01；与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。

三、结论

作为再生医学种子细胞的人羊膜间充质干细胞是一种重要的成体干细胞，在急性心肌梗死、慢性肝纤维化、脊髓损伤及自身免疫性疾病治疗等方面具有显著疗效。采用人羊膜二酶消化法和差速贴壁及传递培养，可分离、纯化人羊膜间充质干细胞，采用已获得专利的人羊膜间充质干细胞培养技术进行原代和传代培养(zl201110080968.6)。第3-5代人羊膜间充质干细胞呈梭形，具有与骨髓间充质细胞相似的表型特征，即经流式细胞仪检测、分析，人羊膜间充质干细胞高表达cd44、cd73、cd90、cd105，其中cd44和cd73表达率高达90％以上，不表达cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr，符合国际细胞治疗协会(internationalsocietyforcellulartherapy，isct)关于间充质干细胞表型特征的定义。且在胞浆内还表达波形蛋白，波形蛋白阳性表达细胞达90％以上，说明本实验所获取的人羊膜间充质干细胞具有较高的纯度。

心肌缺血再灌注损伤是导致体外循环后心肌组织损伤的重要机制之一。大量的基础和临床试验研究认为心肌缺血再灌注损伤发生的机制涉及氧自由基的释放、钙超载、能量代谢障碍及炎症反应等。细胞内h⁺和ca⁺集聚加速了心肌细胞线粒体膜功能变化导致ros产生，心肌缺血再灌注损伤导致ros动态失衡，开启了炎症级联反应的阀门，促进白介素-1、白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-α等炎性因子大量释放，进而延缓心功能恢复，造成心肌线粒体功能损伤，诱导心肌细胞凋亡等。其中白介素-8、肿瘤坏死因子-α在炎症级联反应中发挥重要作用。而在体外循环过程中，心肌缺血再灌注损伤也是引起炎症反应的基础。血液与异物接触，体外循环的机械剪切作用和毒副作用的刺激均可启动全身炎症反应，白细胞的大量集聚并激活了多种炎症因子的释放，进一步延缓心功能的恢复，同时还可造成心肌线粒体功能损伤，诱导心肌细胞凋亡等。实验前18条健康杂种犬的一般情况显示动物满足实验要求，且功能状态基本相似。实验中，心脏血流动力学指标检测结果显示，体外循环后，主动脉开放后，心肌缺血再灌注损伤过程中，与转流前和对照组比较，模型组和移植组犬的lvsp及±dp/dtmax值均存在不同程度的下降，lvedp值则出现不同程度的增高，在开放主动脉15分钟时达到峰值，此后二组的lvsp及±dp/dtmax均值逐渐向转流前水平恢复，lvedp值也有所下降，但一直到开放主动脉后4小时仍未恢复到转流前及对照组水平，表明模型组和移植组心功能均存在不同程度损害。

另外，体外循环后心肌缺血再灌注损伤开放主动脉后，与转流前及对照组比较，模型组和移植组的冠状静脉血浆心肌损伤特异性乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶含量、炎症因子白介素-8和肿瘤坏死因子-α浓度都存在不同程度的升高，il-10浓度明显降低；主动脉开放后15分钟时，il素-8、tnf-α的血浆浓度升高幅度较大，随着再灌注时间的延长，于主动脉开放后2小时逐渐降低，但后二组均未恢复到转流前和对照组水平，且于主动脉开放后4小时达到峰值，而il-10呈现相反的改变，表明模型组和移植组存在明显的心肌损伤和炎症反应。

进一步的组织病理学结果也证实，与对照组相比，模型组和移植组心肌细胞都出现了不同程度的心肌细胞水肿和空泡变性样改变，心肌肌节结构紊乱，心肌间质充血和炎细胞浸润，尤其在模型组还出现了明显的心肌断裂、坏死。且心肌细胞凋亡指数模型组和移植组均高于空白组；bax蛋白表示水平也明显高于对照组，而bcl-2蛋白表达水平则低于对照组，反应线粒体功能损伤程度的线粒体融合蛋白2也明显较对照组增高，这些均从心脏血流动力学变化、心肌酶学指标、特异性蛋白改变、炎症因子和抗炎因子改变、心肌组织病理学改变、心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达改变和心肌线粒体损伤程度8个方面，充分证明了犬体外循环术后，心肌缺血再灌注损伤的变化过程和本实验中体外循环所致心肌缺血再灌注损伤模型的成功建立，与国内外相关文献报道一致。

特别值得关注的是，体外循环后，主动脉开放后，心肌缺血再灌注损伤过程中，与模型组比较，移植组的lvsp及±dp/dtmax下降相对较小，lvedp增高也相对不明显，心功能恢复较快，持续时间较短，一方面反应移植组心功能损伤较轻，另一方面提示移植组心功能恢复较好。心肌损伤的特异性酶学和敏感蛋白检测结果也显示，与模型组比较，体外循环心肌缺血开放主动脉后，移植组冠状静脉血浆乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶和肌钙蛋白i水平均升高程度较小，表明心肌损伤明显较模型组轻。移植组血浆炎症因子il-8和肿瘤坏死因子-α明显低于模型组，而抗炎因子il-10水平则高于模型组。病理组织学检测结果进一步表明移植组心肌组织结构更为完整、有序，心肌组织水肿和炎细胞浸润明显轻于模型组，基本未见心肌细胞坏死、肌肉节断裂显现，间质充血也不明显，表明人羊膜间充质干细胞移植后体外循环所致的心肌缺血再灌注损伤犬心肌组织损伤减轻。

移植组心肌细胞凋亡指数及促凋亡蛋白bax蛋白表达均低于模型组，抗凋亡蛋白bcl-2表达则明显高于模型组，与心肌细胞线粒体功能损伤程度成正相关的mnf2蛋白表达的iod值也明显低于模型组。表明人羊膜间充质干细胞的作用机制与减少细胞凋亡，下调bax、上调bcl-2和下调线粒体融合蛋白2三种蛋白表达有关。且发现散在分布的mab1281表达阳性的人源人羊膜间充质干细胞的归巢、存活，提示人羊膜间充质干细胞在局部发挥了减轻心肌缺血再灌注损伤的活性作用。

上述结果均从功能、结构和蛋白分子不同层面表明，人羊膜间充质干细胞移植后，明显减轻了体外循环后心肌缺血再灌注损伤，明显改善了心脏功能和特异性心肌酶学和功能蛋白指标，并促进心脏功能恢复，不但降低炎症因子水平，还提高了抗炎因子浓度，显著改善了心肌缺血再灌注损伤的急性心肌组织病理学变化，可减少心肌细胞凋亡，降低凋亡相关蛋白表达，提高抗凋亡蛋白水平，并具有一定的心肌线粒体功能保护作用。总之，采用股静脉移植人羊膜间充质干细胞对体外循环心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其作用机制涉及减轻炎症反应，抗心肌细胞凋亡和保护线粒体功能，有望在今后体外循环心脏直视手术恢复转流同时，利用人羊膜间充质干细胞移植，促进心肌缺血再灌注损伤心肌的保护，减轻术后并发症，提高手术成功率，降低死亡率。人羊膜间充质干细胞移植对体外循环后心肌缺血再灌注损伤的重要疗效及相关机制研究，目前国内外尚未见报道。

大量的研究报道，人羊膜间充质干细胞具有极强的抗炎作用，人羊膜间充质干细胞可产生大量的th2细胞因子如ccl2、cxcl8，并抑制cd34⁺细胞和单核细胞分化为树突状细胞，并且在树突状细胞分化过程中人羊膜间充质干细胞可抑制炎症因子如肿瘤坏死因子-α、cxcl-10、cxcl-9和ccl-5。所有的这些功能都提供了人羊膜间充质干细胞抗炎作用的有力证据。本实验中，体外循环心肌缺血再灌注损伤过程中，人羊膜间充质干细胞移植组冠状静脉血浆炎症因子白介素-8、肿瘤坏死因子-α水平明显低于模型组，抗炎因子白介素-10水平高于模型组。心肌组织病理学检查结果也显示，不但移植组缺血再灌注损伤心肌的组织病理学结构较模型组得到明显改善，心肌炎细胞浸润数量明显少于模型组，也进一步印证了人羊膜间充质干细胞的抗炎作用机制的存在。

心肌缺血再灌注损伤导致心功能不全的机制可能是抑制心肌细胞凋亡。凋亡蛋白家族中bax/bcl-2蛋白是主要的调节因子。bax蛋白是促凋亡蛋白bcl-2家族成员之一，其机制目前认为是线粒体膜通透性的改变，从而促进了细胞色素c的释放进一步诱导细胞凋亡。研究表明，bcl-2及bax蛋白参与了心肌缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡，并且p53、肿瘤坏死因子-α同时参与了细胞凋亡的调控。本实验在对体外循环后心肌缺血再灌注损伤过程中，人羊膜间充质干细胞移植组，不但心肌细胞凋亡指数明显低于模型组，且凋亡相关蛋白的调控也得到了有效的调控。人羊膜间充质干细胞对心肌细胞线粒体功能的保护作用，也可能是其抗心肌细胞凋亡的重要机制。线粒体融合蛋白2是重要的线粒体膜融合及分裂调控的核心蛋白，由757个氨基酸残基组成，位于线粒体外膜中，广泛表达于代谢旺盛的心脏、肾脏、神经及骨骼肌中。研究表明，线粒体融合蛋白2基因功能紊乱及其过表达可导致许多疾病的发生，包括腓骨肌萎缩症、ii型糖尿病、肥胖病、动脉粥样硬化、高血压等。线粒体融合蛋白2可促进细胞内氧化活性物质ros增多及影响细胞的能量代谢，甚至导致胰岛素抵抗的发生，这也是体外循环心肌缺血再灌注损伤发生的主要因素。线粒体融合蛋白2表达可诱导平滑肌细胞凋亡，也可通过调节线粒体膜势能变化引起氧化呼吸链复合体表达量下降，其蛋白表达水平增高可能与心肌线粒体功能成负相关。本实验中，模型组和移植组线粒体融合蛋白2的蛋白表达水平高于转流前及空白组，同时期凋亡指数也大幅度升高。与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组线粒体融合蛋白2蛋白表达升高幅度较小，随着灌注时间的延长逐渐而进一步降低，同时心肌凋亡指数升高幅度也相对较低。由此可推测，人羊膜间充质干细胞治疗体外循环后心肌缺血再灌注损伤犬的线粒体融合蛋白2蛋白水平下调同样也反映了人羊膜间充质干细胞抑制细胞凋亡、保护心肌线粒体功能也是人羊膜间充质干细胞治疗体外循环心肌缺血再灌注损伤的重要作用机制。

本发明的有益之处在于：本发明提供的一种人羊膜间充质干细胞的应用，即在制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。在体外循环心肌缺血再灌注过程中，人羊膜间充质干细胞可有效保护心肌细胞在缺血再灌注中的损伤，明显改善心脏功能，降低特异性心肌损伤特异性酶学指标和肌钙蛋白i水平，降低血浆炎症因子白介素-8和肿瘤坏死因子-α水平，提高血浆抗炎因子白介素-10含量，明显改善心肌组织病理学改变，减少心肌细胞凋亡，降低促细胞凋亡蛋白表达水平，增高抗凋亡蛋白表达量，并可保护心肌细胞线粒体功能。提示转流同时，静脉移植人羊膜间充质干细胞，可通过减轻缺血再灌注心肌损伤，降低炎症反应和提高抗炎作用，抗心肌细胞凋亡及条件凋亡相关蛋白表达，对体外循环后的心肌缺血再灌注损伤发挥明显治疗作用。可有效保护心脏功能或促进术后心功能的恢复，提高手术成功率或减轻体外循环的术后并发症。于体外循环手术恢复心脏血供的转流同时，采用一定细胞数量范围人羊膜间充质干细胞股静脉移植技术，治疗体外循环手术后心肌缺血再灌注损伤，可明显改善心脏血流动力学，降低特异性心肌损伤酶学和标志蛋白分子水平，改善心肌组织病理学变化，降低心肌细胞凋亡指数，调节凋亡相关蛋白，减轻线粒体功能，并归巢、存活于心肌组织中，多方面作用产生良好的治疗效果。在保证疗效的前提下，最大限度地减少了人羊膜间充质干细胞制剂的用量。

附图说明

图1是本发明的人羊膜间充质干细胞的生长形态的倒置相差显微镜(放大100倍)图；

图2是流式细胞术分析人羊膜间充质干细胞免疫表型(cd90fitc)图；

图3是流式细胞术分析人羊膜间充质干细胞免疫表型(cd73pe)图；

图4是流式细胞术分析人羊膜间充质干细胞免疫表型(cd105percpcy5.5)图；

图5是流式细胞术分析人羊膜间充质干细胞免疫表型(cd44fitc)图；

图6是流式细胞术分析人羊膜间充质干细胞免疫表型(cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-drpe)图；

图7是第3代人羊膜间充质干细胞波形蛋白表达(免疫细胞化学染色)图；

图8是体外循环犬缺血再灌注心肌组织病理he染色的病理组织学变化图(leica光学显微镜，放大200倍)。

图9是心肌缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡指数的变化图(leica光学显微镜，放大200倍)。

图10是免疫组化染色mab1281阳性表达细胞归巢、存活情况图(leica光学显微镜，放大200倍)。

图11是体外循环缺血再灌注过程中心肌细胞bax蛋白表达的变化图(leica光学显微镜，放大200倍)。

图12是体外循环缺血再灌注过程中心肌细胞bcl-2蛋白表达的变化图(leica光学显微镜，放大200倍)。

图13是体外循环犬缺血再灌注心肌线粒体融合蛋白2免疫组化结果图(leica光学显微镜，放大200倍)。

图中附图标记的含义：图1：a-原代人羊膜间充质干细胞,b-第3代人羊膜间充质干细胞；图7：a-pbs对照组(放大100倍)，b-pbs对照组(放大200倍)，c-人羊膜间充质干细胞阳性波形蛋白表达(放大100倍)，d-人羊膜间充质干细胞阳性波形蛋白表达(放大200倍)；图8～图13：a-对照组，b-模型组，c-移植组。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。

实施例1

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射。

实施例2

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射。人羊膜间充质干细胞是经过传代培养得到的第3～5代的细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。

实施例3

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经股静脉静脉注射。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第3～5代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。

实施例4

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射。其中，每7ml人羊膜间充质干细胞注射液含有人羊膜间充质干细胞5×10⁸个。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第3～5代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。

实施例5

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环术心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经股静脉静脉注射。其中，每2ml人羊膜间充质干细胞注射液大约含有人羊膜间充质干细胞1×10⁷个。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第4代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。

实施例6

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射。其中，每5ml人羊膜间充质干细胞注射液含有人羊膜间充质干细胞2.5×10⁸个。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第3代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。人羊膜间充质干细胞的密度为1×10⁸个/ml。

实施例7

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射。其中，每5ml人羊膜间充质干细胞注射液大约含有人羊膜间充质干细胞5×10⁷个。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第5代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。人羊膜间充质干细胞的密度为4×10⁷个/ml。

实施例8

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射。其中，每4ml人羊膜间充质干细胞注射液含有人羊膜间充质干细胞9×10⁷个。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第3代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。人羊膜间充质干细胞的密度为3×10⁷个/ml。

实施例9

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经股静脉静脉注射。其中，每7ml人羊膜间充质干细胞注射液大约含有人羊膜间充质干细胞4×10⁷个。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第4代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。人羊膜间充质干细胞的密度为8×10⁶个/ml。

实施例10

人羊膜间充质干细胞在制备治疗体外循环心肌缺血再灌注损伤的制剂中的应用。具体应用方法为：将人羊膜间充质干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜间充质干细胞注射液，然后经静脉注射。其中，每6ml人羊膜间充质干细胞注射液大约含有人羊膜间充质干细胞1×10⁷个。人羊膜间充质干细胞按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养，是经过传代培养得到的第5代人羊膜间充质干细胞，其90％以上胞浆均表达波形蛋白，且表达cd90、cd105、cd44和cd73为阳性，cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr为阴性。人羊膜间充质干细胞的密度为2×10⁶个/ml。