一种多诱导剂制备大鼠肝S9的方法与流程

本发明属于蛋白酶学领域，具体涉及一种多诱导剂制备大鼠肝s9的方法。

背景技术：

大鼠肝细胞s9是大鼠肝实质细胞匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的cyps等药物代谢酶，其在药物体外代谢的研究中具有快速简便、灵敏、经济且可进行高通量筛选的特点，因此常用作体外研究药物代谢和药物相互作用的工具。同时许多致癌剂的生物转化是依靠细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的，所以大鼠肝s9是许多体外研究致癌剂生物转化的活化系统。

传统的大鼠肝s9诱导剂为多氯联苯，但因其是致癌剂，严重污染环境，现许多国家已禁止生产。本发明通过多种诱导剂联合诱导的方法制备大鼠肝s9，获得具有高酶活性的大鼠肝s9。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种可以获得高产量的肝s9以及较高的p450酶含量的大鼠肝s9制备方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法制备大鼠肝s9：大鼠肝s9的诱导及制备方法的步骤包括：(a)诱导剂以灌喂和腹腔注射的方式诱导sd大鼠；(b)断头处死大鼠，无菌条件下，清洗液冲洗肝中残血，取出肝脏；(c)按一定的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；(d)将匀浆好的组织液低速离心，收集上清和沉淀，沉淀加入一定比重的储存液重悬后再次低速离心取上清，合并上清经冷冻高速离心后收集上清，即肝s9；(e)检测依赖肝s9的诱变剂环磷酰胺对哺乳动物细胞的致畸变作用；本发明提供的大鼠肝s9制备方法显著提高了肝s9的酶活性。

可选的诱导剂为苯巴比妥钠、β-奈黄酮和地塞米松。

可选的诱导方法为大鼠连续3d腹腔注射剂量为80mg/kg的苯巴比妥钠，灌喂剂量为80mg/kg地塞米松和80mg/kg的β-萘黄酮，第4d注射剂量为40mg/kg的苯巴比妥钠，灌喂剂量为40mg/kg地塞米松和40mg/kg的β-萘黄酮。

可选的除去肝中残血的方法是将预冷的清洗液经肝门静脉灌洗除去残血，清洗液为含1.15％kcl和20％肝素(1500u/ml)，ph为7.4的10mmpbs。

可选的肝湿重比的比例为1∶2-1∶4。

可选的储存缓冲液为0.15mkcl(ph7.4)。

可选的加入预冷的储存缓冲液的量是沉淀重量的1-2倍。

本发明提供了一种多诱导剂联合诱导制备大鼠肝s9的方法，大大提高了肝s9的酶活性。

附图说明

图1：ca实验检测大鼠肝s9对染色体畸变的影响

图2：环磷酰胺作用后的chl细胞(a.正常、b.双着丝粒、c.交联、d.断裂)

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

本发明选择体重为230±20g的sd雄性大鼠制备肝s9。具体操作如下：

1、sd大鼠以腹腔注射和灌喂的方法连续诱导4d，大鼠连续3d腹腔注射剂量为80mg/kg的苯巴比妥钠，灌喂剂量为80mg/kg地塞米松和80mg/kg的β-萘黄酮，第4d注射剂量为40mg/kg的苯巴比妥钠，灌喂剂量为40mg/kg地塞米松和40mg/kg的β-萘黄酮，期间正常饮食，在最后一次给药后，禁食，可正常饮水，24h后断头处死；

2、在无菌条件下剖腹，用预冷的含1.15％kcl和20％肝素(1500u/ml)，ph为7.4的10mmpbs经肝门静脉灌洗法除去肝中残血，洗至土黄色；

3、快速剪下肝脏，立即用预冷清洗液进一步洗去多余血污；

4、将清洗干净的肝脏放置冰上预冷的离心管中，称重，然后将其按1∶2-1∶4的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液中，充分剪碎，然后在冰浴中匀浆；

5、将匀浆好的组织液，倒入预冷50ml的离心管中，4℃，1500rpm离心5min，收集上清，将沉淀用1∶1-1∶2储存液重悬，再次离心收集上清；

6、将收集的上清于冷冻高速离心机9000×g离心15-20min，取其上清液即为s9；

7、试验前一天，将一定数量的chl细胞接种于培养皿(瓶)中，放c02培养箱内培养；

8、设置分组，方案l肝s9为本发明诱导方法制备的肝s9，方案2肝s9为苯巴比妥钠和β-奈黄酮联合诱导制备的肝s9，阴性为不加受试物环磷酰胺(cp)组，阳性为加致变剂丝裂霉素mmc药物组；

9、配置浓度为3％的肝s9的活化系统(s9mix)：

用无血清1640培养液补足至1ml；

10、试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物环磷酰胺(cp)、s9mix(不加s9mix时，需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。结束后，吸去含受试物的培养液，用无血清1640液洗细胞3次，加入含10％胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24+2h收获细胞。于收获前2-3h，加入终浓度为0.2μg/ml细胞分裂中期阻断剂秋水仙素；

11、收获细胞时，用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10％胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1200r/min的速度离心5min，弃去上清液，加入0.075mol/lkcl溶液低渗处理20-30min，继而以新配制的甲醇和冰醋酸液(容积比为3∶1)进行固定2次，每次20min，按常规制片，用姬姆萨染液染色；

12、分散良好的中期分裂相(染色体数为2n±2)进行染色体畸变分析；

13、在苯巴比妥钠和β-奈黄酮联合诱导制备的肝s9存在时，cp对chl细胞的致畸变率为26％，而在本发明专利提供的肝s9制备方法得到的肝s9存在时，cp对chl细胞的致畸变率可达45％，显著提高了cp对chl细胞的致畸变率。

以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

技术特征：

技术总结
本发明提供一种多诱导剂制备大鼠肝S9的方法，包括步骤：(a)诱导剂以灌喂和腹腔注射的方式诱导大鼠；(b)断头处死大鼠，无菌条件下，清洗液冲洗肝中残血，取出肝脏；(c)按一定的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；(d)将匀浆好的组织液低速离心，收集上清和沉淀，沉淀加入一定比重的储存缓冲液重悬后再次低速离心取上清，合并上清经冷冻高速离心后收集上清，即肝S9；(e)检测依赖肝S9的诱变剂环磷酰胺对哺乳动物细胞的致畸变作用；本发明提供的大鼠肝S9制备方法显著提高了肝S9的酶活性。

技术研发人员：不公告发明人
受保护的技术使用者：江苏齐氏生物科技有限公司
技术研发日：2016.10.31
技术公布日：2018.05.11