本发明涉及植物细胞培养方法及生产植物细胞次级代谢产物的方法。
背景技术：
天山雪莲为菊科植物雪莲(Saussureainvolucrata(Kar.etKir)Sch.-Bip.Linnaea)的干燥地上部分，是中国特有的药用植物，其有效成分主要包括生物碱类化合物、黄酮类化合物、苯丙素类化合物、倍半萜内酯及其苷类化合物、多糖类化合物及挥发油类化合物，一般以总黄酮及总蛋白含量作为评价天山雪莲质量的指标。因为野生资源日益匮乏，天山雪莲已被国家列为二级濒危植物，采集得到的天山雪莲已经无法满足日益增长的医疗保健用途需求。通过植物细胞工程技术对雪莲进行细胞培养，找到了解决雪莲短缺的良好途径，但当前大规模培养天山雪莲细胞时，一方面由于天山雪莲细胞耐受剪切力较低造成难于搅拌均匀，并随之带来了需氧量不均匀等问题，另一方面大规模培养时得到的天山雪莲细胞与天然的天山雪莲在有效成分含量，尤其是“总黄酮和总蛋白含量”上还有差距。
中国专利ZL201210021722.6公开了一种带有曝气装置的波浪回头式生物反应器，通过改进的生物反应器结构可以解决天山雪莲细胞耐受剪切力较低造成难于搅拌均匀的问题，但如何优化继代培养条件，提高天山雪莲细胞的有效成分含量，并提供一种稳定的能够大规模培养天山雪莲细胞并能够使其有效成分含量保持在较高水平的的继代工艺成为现有技术中亟待解决的问题。
技术实现要素：
为解决前述技术问题，本发明提供了一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，通过优化工艺条件，不但能够在大规模培养天山雪莲细胞时提高细胞产量，而且能够提高培养得到的天山雪莲细胞中有效成分。
本发明提供了一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于所述工艺包括以下步骤：
1)天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行Ser-137、uv-B诱变，低温4℃处理，将MS培养基的含糖量提高至50-100g/L后作为筛选培养基，以筛选培养基反复进行筛选获得细胞系，进行细胞系筛选时的培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，每两周继代一次；
2)摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，颜色鲜亮，质地紧实的固体细胞放入含有培养液的摇瓶中，培养液为含有0.4～0.6mg/L 6-BA、0.8～1.2mg/L NAA的MS生长培养基，所述MS生长培养基的含糖量为20～40g/L，细胞接种量为30～50g/L，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，摇床转速为100-120rpm，每7-10天继代一次；
3)摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为7-10天，反应器中加入培养液，所述培养液为含有0.4～0.6mg/L6-BA、0.8～1.2mg/LNAA的MS培养基，所述MS生长培养基的含糖量为20～40g/L，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，通气保持反应器中培养液的溶氧浓度在2-6mg/L。
所述的的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于步骤3)中，每次继代培养细胞鲜重翻倍量为3-5倍，培养完成时细胞鲜重不低于150g/L。
所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于步骤3)中，反应液中培养液的溶氧浓度保持在2～4mg/L。
所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于所述反应器为带有曝气装置的波浪回头式生物反应器。所述的带有曝气装置的波浪回头式生物反应器如中国专利ZL201210021722.6中所述。
所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于步骤3)摇瓶转反应器培养包括以下步骤
3.1)摇瓶转20L反应器继代培养，将摇瓶细胞无菌接入20L反应器中，接种量为30～50g/L，保持反应器振频为5-15rpm，通气量为0.1-0.3m3/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L
3.2)20L转200L反应器继代培养，在20L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接入200L反应器中，保持反应器振频为10-20rpm，，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为0.4-1.0m3/h，混合气体的初始氧气比例为零，随着培养过程梯度增加氧气比例，每次将氧气占混合气体的体积百分比含量提高5-10个百分点，将溶氧浓度控制在2mg～6mg/L，
3.3)200L转1000L反应器继代培养：在200L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将200L反应器中完成继代的细胞种源转接到1000L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为10-15rpm，培养第6天以上的反应器振频为15-25rpm；并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为1.5-4.0m3/h，混合气体的初始氧气比例为零，随着培养过程梯度增加氧气比例，每次将氧气占混合气体的体积百分比含量提高10-20个百分点，将溶氧浓度控制在2mg～6mg/L。
本发明提供的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，一方面在利用现有的波浪回头式生物反应器的基础上，优化了培养条件，找到合适的反应器振频，使植物细胞能够在培养时既能均匀分散，又不会因剪切力对细胞产生损伤，同时在进行工艺优化时我们还发现，为使天山雪莲细胞能够快速生长，需要将培养液中的溶氧量控制在2-6mg，一旦溶氧量低于2mg/L将会出现细胞褐变死亡的情况，但在进一步研究中我们意外的发现，通过调节培养液中的溶氧量可以促进细胞中总蛋白和总黄酮含量的提高，当溶氧量为较低的2-4mg/L时，有效成分含量提高较为明显，且不同类的有效成分含量均有明显提高。说明优化的工艺更有利于天山雪莲细胞中有效成分的均衡产生。
具体实施方式
1)天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行Ser-137、uv-B诱变，低温4℃处理，采用含糖量为50-100g/L的高糖MS培养基反复进行筛选获得细胞系并命名为SE-5，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，每两周继代一次；
2)摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，颜色鲜亮，质地紧实的固体细胞放入含有培养液的摇瓶中，所述培养液为含有0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS生长培养基(含糖量30g/L)，接种量为30～50g/L，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，摇床转速为100-120rpm，每7-10天继代一次；继代完成后细胞鲜重不小于150g/L；
3)摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为7-10天，反应器中加入含有0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS培养基作为培养液，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，通气保持反应器中培养液的溶氧浓度在2-6mg/L；
3.1)摇瓶转20L反应器继代培养，将摇瓶细胞无菌接入20L反应器中，接种量为30～50g/L，保持反应器振频为5-15rpm，通气量为0.1-0.3m3/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L；
3.2)20L转200L反应器继代培养，在20L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接入200L反应器中，保持反应器振频为10-20rpm，，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为0.4-1.0m3/h，混合气体的初始氧气比例为零，随着培养过程梯度增加氧气比例，每次将氧气占混合气体的体积百分比含量提高5-10个百分点，将溶氧浓度控制在2mg～6mg/L；
3.3)200L转1000L反应器继代培养：在200L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将200L反应器中完成继代的细胞种源转接到1000L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为10-15rpm，培养第6天以上的反应器振频为15-25rpm；并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为1.5-4.0m3/h，混合气体的初始氧气比例为零，随着培养过程梯度增加氧气比例，每次将氧气占混合气体的体积百分比含量提高10-20个百分点，将溶氧浓度控制在2mg～6mg/L。
步骤3)中的反应器为如中国专利ZL 201210021722.6中所述的带有曝气装置的波浪回头式生物反应器。
最终培养完成后取天山雪莲细胞，提取并检测总黄酮和总蛋白含量(占细胞干重的重量百分比)
氧气占混合气体的体积百分比含量＝氧气通气量/(氧气通气量+空气通气量)×100％
实施例1～4溶氧浓度与反应器继代培养的细胞产量及有效成分含量见下表，高溶氧培养时间占比是溶氧浓度＞4mg/L的培养时间在每次继代培养的总培养时间中的占比。
结果表明，当培养液的溶氧量为2-6mg/L时，在继代培养结束后培养液中的细胞鲜重均大于150g/L，说明采用本发明提供的工艺，能够实现对天山雪莲细胞的大规模继代培养。而有效成分含量检测表明，溶氧浓度控制在2-4mg/L的实施例1，作为有效成分产量标志的总黄酮和总蛋白的含量均显著高于其他实施例。说明优选的溶氧浓度含量可以提高天山雪莲细胞的有效成分含。