一种具有抗肿瘤功能的多肽的制作方法

本发明属于抗肿瘤药物筛选技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤功能的多肽。

背景技术：

黑色素瘤是一种恶性程度比较高的肿瘤，主要由皮肤和其他器官的黑素细胞产生的。原发性黑素瘤均由表皮内的黑素细胞增生所致，其表现为色素浓重的逐渐增大，周围可绕以红晕。其发病率相对低，但恶性度大，死亡率高，尤其是转移性恶性黑色素瘤。

在医学上，对于恶性黑色素瘤的治疗，目前除了手术切除的方法之外，像化疗、放疗等手段对黑色素瘤的治疗效果都是不尽人意的。虽说手术治疗对早期的实体瘤治疗效果较好，但是，现在很多肿瘤在发现的时候已经发生了转移、病变，手术治疗难以解决根本问题，并且手术切除具有很高的风险，会带来比较大的副作用。因此，寻求一种有效治疗恶性黑色素瘤的方法仍然是医学界的一大难题。

近年中，多数人把目光投向药物治疗，药物治疗不仅可以作为一种治疗黑色素瘤的有效手段，并且可以作为手术治疗后的一种辅助疗法，同时起到预防、治疗与防止复发的效果。因此，研发一种高效低毒的抗黑色素瘤药物迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤功能的多肽，能特定性的杀死黑色素瘤细胞。

本发明提供的多肽，其结构式如下：

再一个方面，本发明所提供的多肽用于制备用于治疗黑色素瘤的制品；

本发明再一个方面提供一种用于治疗黑色素瘤的溶液，其中包含有药理有效浓度的上述多肽；

所述的溶液，为hepes缓冲溶液，ph值为7.4；

所述的药理有效浓度，其浓度为2-10mm；

所述的药理有效浓度，优选为8mm。

本发明的多肽的氨基酸残基良好的生物相容性决定了多肽分子绿色环保的特点，因此相对于其他的药物来说毒性更小。在药效方面，本发明的多肽在杀死黑色素瘤细胞的同时不影响正常细胞的生长，具有很强的选择性，对人体健康影响较小。本发明的多肽分子具有高效杀死黑色素瘤细胞的能力，杀伤率可以达到98％以上，具有很好的药物开发前景。

附图说明

图1：结构式图，其中a)为多肽的分子式，b)和c)为多肽在酪氨酸酶催化下可能的反应式；

图2：其中a、b分别为加酶前后的透射电子显微镜图和溶液状态图；

图3：.a、b、c、d分别为多肽溶液加入完全培养基、含b16细胞的培养基、含hela细胞的培养基和含nih3t3细胞的培养基一天之后的溶液状态；

图4：b16细胞在8mm多肽溶液中培养两天后，在倒置荧光显微镜下的观察图；

图5：不同浓度的多肽与b16细胞作用不同时间后的ldh释放实验图；

图6：.nih3t3细胞和hela细胞在8mm多肽溶液中培养两天后，在倒置荧光显微镜下的观察图。

具体实施方式

本发明的多肽是借助微波多肽合成仪，利用固相合成方法合成的，相应氨基酸原料均购买于吉尔生化有限公司。酪氨酸酶购买于sigma公司，小鼠黑色素瘤细胞(b16)购买于上海细胞库。

实施例1多肽的设计及效果检测

申请人设计并合成一种含有dopa残基的多肽分子，利用dopa残基对酪氨酸酶的响应性，同时结合黑色素瘤细胞过量表达酪氨酸酶、能够促进含dopa多肽分子在黑色素瘤细胞中的组装的特点，达到利用含dopa多肽分子杀死黑色素瘤细胞的效果。

本发明的多肽的结构式如下：

该多肽分子在水溶液中，浓度在2-8mm时能够自组装形成细的纳米纤维，当加入≥10u酪氨酸酶之后，在酪氨酸酶的催化下，多肽分子侧链上的二酚羟基氧化转变为苯醌，随后，苯醌与多肽侧链上的氨基发生迈克尔加成反应，如图1.b)、c)所示，促使纤维之间交联形成网络状凝胶。将一定量的多肽溶液与一定数量的b16细胞混合，最终多肽浓度在2-8mm之间，细胞的浓度大约10⁴-10⁶个/ml时实验发现，在b16细胞释放大量酪氨酸酶的催化下，多肽溶液转变为凝胶，同时b16细胞被大量杀死。

将多肽溶解在400ul浓度为25mmhepes缓冲溶液中，分别添加0u和10u酪氨酸酶，确保多肽最终浓度为8mm,静置一周后均自组装形成纳米纤维，并且不加酶的呈流动状态，加酶的形成可以倒立成固状水凝胶，如图2所示。

实施例2：b16细胞诱导下多肽成胶

将多肽溶解在400ul浓度为25mmhepes缓冲溶液中，分别加入100ul的完全培养基、含b16细胞的培养基、含hela细胞的培养基和含nih3t3细胞的培养基，确保最终多肽浓度为8mm，加入的细胞培养基中细胞的密度大约在10⁶个/ml。实验结果发现，只有加入含b16细胞的培养基的多肽溶液在一天之后形成可以倒立的水凝胶，其余的均呈可流动的液体状态，如图3所示。

实施例3：多肽水凝胶对b16细胞的抗肿瘤性能

上述实验证明了b16细胞能促使多肽溶液成胶，为了检测b16细胞在多肽水凝胶中的生长状态，使用荧光染料calceinam与pi进行活/死细胞染色，然后使用倒置荧光显微镜观察。结果显示，多肽水凝胶上方，大量b16细胞呈碘化丙啶pi染色后的红色，细胞形态为收缩的球状，几乎观测不到calceinam染色后的绿色细胞，表示大量b16细胞已经死亡，如图4所示。

考察了多肽浓度对b16细胞的杀伤能力的影响，实验结果如图5所示，发现当b16细胞在浓度≥2mm/l多肽溶液中培养超过三天后，多肽对b16细胞的杀死率可以达到99％以上。即使在低浓度的多肽溶液中，杀死率依然可以达到60％以上，表现出良好的抗黑色素瘤效果。

实施例4：多肽对其他细胞毒性的研究

将nih3t3细胞和hela细胞分别与多肽溶液混合培养，两天后，用荧光染料calceinam与pi进行活/死细胞染色，然后使用倒置荧光显微镜观察，结果显示nih3t3细胞和hela细胞大量呈表示存活的绿色；极少量呈表示细胞死亡的红色，如图6所示。说明本发明的多肽可以高效杀死黑色素瘤细胞，且对其他细胞影响较小，具有很强的专一性。

技术特征：

技术总结
本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤功能的多肽，本发明的多肽能特定性的杀死黑色素瘤细胞。本发明的多肽的氨基酸残基良好的生物相容性决定了多肽分子绿色环保的特点，因此相对于其他的药物来说毒性更小。在药效方面，本发明的多肽在杀死黑色素瘤细胞的同时不影响正常细胞的生长，具有很强的选择性，对人体健康影响较小。本发明的多肽分子具有高效杀死黑色素瘤细胞的能力，杀伤率可以达到98％以上，具有很好的药物开发前景。

技术研发人员：赵玉荣;徐海;陈翠霞;白靖琨;杨威
受保护的技术使用者：中国石油大学（华东）
技术研发日：2017.03.29
技术公布日：2017.07.14