本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种分离高纯度橄榄苦苷的方法。
背景技术：
橄榄苦苷(oleuropein)是一种环烯醚萜苷类化合物，现代药理学研究表明：橄榄苦苷具有抗炎、抗真菌、抗病毒、抗氧化，抗癌和降血糖等多种活性。
近年来，国内外学者对橄榄苦苷的提取纯化方法进行了有益探索。如发明名称为“一种纯化橄榄苦苷的方法”(申请号为201010549802.x)的中国发明专利公开了一种从油橄榄叶中提取橄榄苦苷的方法：将油橄榄叶用乙醇提取，然后加入活性炭脱色，回收乙醇后用正丁醇萃取，正丁醇萃取相回收溶剂后用制备型高速逆流色谱仪分离，可以得到纯度90％以上的橄榄苦苷纯品。但是该专利使用活性炭脱色并正丁醇萃取，溶剂耗费较多，回收正丁醇能耗大，并且最后工艺回收率较低，整个工艺橄榄苦苷得率仅达到1％左右。发明名称“一种橄榄苦苷的制备方法”(申请号：201510270831.5)的中国发明专利公开了一种制备橄榄苦苷的方法，是将油橄榄叶以乙醇为夹带剂，通入co2进行萃取，将所得萃取物浓缩后用大孔树脂吸附，洗脱物用高速逆流色谱分离，以氯仿-甲醇-水(10:5:7，v:v)为两相溶剂，制备得到橄榄苦苷。该专利使用超临界co2进行提取，设备和工艺成本较高，制约了它的进一步发展。
技术实现要素：
针对上述现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种分离高纯度橄榄苦苷的方法，在获得的高纯度橄榄苦苷的基础上，也获得更大的得率，并通过减少工艺步骤降低生产成本，从而解决现有技术中存在的问题。
本发明的分离高纯度橄榄苦苷的方法，包括如下的步骤：
1)制备油橄榄叶提取物：
使用60％-90％(体积比)的乙醇从油橄榄叶中提取获得油橄榄叶提取物，
所述的提取方法为浸泡提取法或加热回流提取
2)分离溶剂系统的选择：
将正丁醇、乙酸乙酯、甲醇和水混合作为分离溶剂系统，振摇后静置分层，将上、下相分开分别作为固定相和流动相；
作为实施例的优选，其中正丁醇、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为1:19:1:19；
3)首先将固定相充满逆流色谱仪的分离柱，然后开动逆流色谱仪主机，达到设定转速后，再向其中泵入流动相，待两相在分离柱中达到动态平衡后，通过进样阀将油橄榄叶提取物注入，自动馏分收集器接受馏分；
4)将收集的馏分通过高效液相色谱检测，合并含有橄榄苦苷的馏分，回收溶剂后得到橄榄苦苷。
所述的步骤2)中，所用溶剂系统的ph值为2-14。
所述的步骤2)中，可以以溶剂系统中的上相为固定相，下相为流动相；也可以以溶剂系统中下相为固定相，上相为流动相。
所述的步骤3)中，逆流色谱仪可以采用正转模式，也可以采用反转模式。
本发明优点为分离成本低，制备过程安全，并且分离过程能够连续进行，操作简单，橄榄苦苷产品纯度可以达到90％以上。与柱层析等方法比较，它不使用固态的载体，因此不存在固体载体造成的样品不可逆吸附和损耗，分离效率高，整个分离工艺适合于工业化生产，能够最大限度的利用原料，降低生产成本，是一种高效快捷的从油橄榄叶提取物中分离高纯度橄榄苦苷的方法。
具体实施方式
本发明实施例中所使用的分离设备逆流色谱仪，根据所需目标分离量的不同，可以选择分析型、半制备型和制备型逆流色谱仪。
逆流色谱法分离高纯度橄榄苦苷的方法，包括以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水按照一定体积比混合后静置分层，构成逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系；将固定相以较大流速泵入逆流色谱仪分离柱中；待柱中充满固定相后，开机，使逆流色谱仪主机以设定转速转动，然后以一定流速将流动相泵入分离柱中；待两相在分离柱中达到动态平衡后，通过进样阀进样；自动馏分收集器收集馏分；用高效液相色谱检测，将含有橄榄苦苷成分的馏分合并后回收溶剂后得到橄榄苦苷。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
1.样品：取1kg油橄榄叶，加入15升90％(体积比)的乙醇，加热回流提取2次，每次2h，将提取液合并后减压回收乙醇，得到油橄榄叶提取物。
2.仪器：dehpcccspectrum逆流色谱仪，英国de公司。
3.制备方法：将正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水按照1:19:1:19(v:v)的比例充分混合均匀后放置在分液漏斗中静置过夜。将上、下相分别放出后超声20min脱气，以上相为固定相，下相为流动相。首先将固定相泵入逆流色谱仪螺旋管中，流速6ml/min，待螺旋管完全充满固定相后，开启逆流色谱仪主机，缓慢调整螺旋管转速至1600r/min，同时以6ml/min的流速泵入流动相。当系统达到平衡，将120mg前述油橄榄提取物溶解在6ml上、下相的混合溶液中，通过进样阀注入螺旋管中，设置仪器温度为30℃。自动馏分收集器接样，3ml为一份，经hplc检测，合并含有橄榄苦苷的馏分，减压浓缩后得到乳白色粉末。经过核磁共振、质谱鉴定即为橄榄苦苷，测定纯度≥90％。整个实施过程的橄榄苦苷得率达到83.2％。
实施例2
1.样品：取1kg油橄榄叶，加入12升80％(体积比)的乙醇，加热回流提取2次，每次2h，将提取液合并后减压回收乙醇，得到油橄榄叶提取物。
2.仪器：tbe-300b逆流色谱仪，中国上海同田生物技术有限公司。
3.制备方法：将正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水按照1:19:1:19(v:v)的比例充分混合均匀后放置在分液漏斗中静置分层。将上、下相分别放出后超声20min脱气，以上相为固定相，下相为流动相。首先将固定相泵入逆流色谱仪螺旋管中，流速20ml/min，待螺旋管完全充满固定相后，开启逆流色谱仪主机，缓慢调整螺旋管转速至950r/min，同时以1.5ml/min的流速泵入流动相。当螺旋管尾端流出流动相，系统达到平衡，将400mg前述甘肃棘豆总生物碱样品溶解在20ml上、下相的混合溶液中，通过进样阀注入螺旋管中，设置恒温水浴为25℃，紫外检测器检测波长为254nm，自动馏分收集器接样，5ml为一份，hplc检测，合并含有橄榄苦苷的馏分，减压浓缩后得到乳白色粉末。经过核磁共振、质谱鉴定即为橄榄苦苷，测定纯度≥90％。整个实施过程的橄榄苦苷得率达到82.6％。