LncRNAHOXD‑AS1在前列腺癌诊断和药物治疗中的应用的制作方法

文档序号:11171973阅读:684来源:国知局
LncRNA HOXD‑AS1在前列腺癌诊断和药物治疗中的应用的制造方法与工艺

本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及lncrnahoxd-as1在前列腺癌诊断和药物治疗中的应用。



背景技术:

前列腺癌(prostatecancer,pca)在中国的发病率逐年增高,已经成为男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤,严重威胁老年男性健康。早期的前列腺癌主要通过手术治疗,但部分患者术后出现肿瘤的原位复发或远处转移。部分患者被确诊时已经是晚期,手术成功几率极低。雄激素剥夺疗法(androgen

deprivationtherapy,adt)或称去势疗法(castration)是晚期前列腺癌的一线治疗方法,虽然大约90%的前列腺癌病人对去势治疗有良好的反应(表现为前列腺特异性抗原psa的下降和肿瘤缩小),但是通常在18~24个月后肿瘤对去势治疗不再应答,发展为去势抵抗前列腺癌(castrationresistanceprostatecancer,crpc)。去势抵抗前列腺癌预后差,是前列腺癌患者死亡的主要原因。紫杉醇类药物(如多西他赛)是去势抵抗前列腺癌的一线用药,虽然这类药物能够缓解crpc的症状和降低psa水平,但是患者的总体生存受益并不明显。所以,临床上亟待发现预测前列腺癌复发预后(如去势治疗敏感性和化疗敏感性)的标记物,以及开发前列腺癌治疗的新靶点。

近年来大量研究表明,长链非编码rna(longnoncodingrna,lncrna)是指转录本长度大于200个核苷酸、不编码蛋白的非编码rna亚类,在表观遗传水平广泛参与调控人体的各种生命活动进程。lncrna在多种恶性肿瘤中表达异常,并通过对下游靶基因的调控,在肿瘤发生、发展中行使着重要的癌基因或抑癌基因的功能。最近的研究发现lncrna也在前列腺癌中发挥重要作用。例如lncrnahotair在去势抵抗前列腺癌(crpc)中高表达,敲低hotair能够抑制前列腺癌细胞的增殖及去势抵抗。schlap1在前列腺癌和转移性前列腺癌中高表达,在前列腺癌细胞株中敲低schlap1能够抑制其增殖,而在前列腺上皮细胞株rwpe-1中过表达schlap1则能够促进其侵袭能力。目前的研究虽然揭示了lncrna参与了前列腺癌的增殖、转移、雄激素信号转导等过程,但是仍未能清楚阐明去势抵抗前列腺癌的发生机制。



技术实现要素:

本发明目的在于克服现有技术存在的不足,而提供lncrnahoxd-as1在前列腺癌诊断和药物治疗中的应用。为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:lncrnahoxd-as1基因及其表达产物在筛选或制备用于诊断或治疗前列腺癌、前列腺癌预后复发或前列腺癌临床分期的药物制剂、芯片或试剂盒中的用途,lncrnahoxd-as1基因序列如seqidno:1所示。lncrnahoxd-as1又称haglr,其基因id为401022。

另外,本发明还提供lncrnahoxd-as1抑制剂在制备用于治疗前列腺癌的药物制剂中的应用,所述lncrnahoxd-as1抑制剂通过抑制lncrnahoxd-as1基因表达或降低lncrnahoxd-as1表达水平来治疗前列腺癌,所述lncrnahoxd-as1基因序列如seqidno:1所示。

另外,本发明还提供一种lncrnahoxd-as1的特异性探针,所述探针的dna序列如seqidno:2所示。

另外,本发明还提供一种lncrnahoxd-as1的特异性引物,所述引物为由如seqidno:3和seqidno:4所示的dna序列组成的引物对。

另外,本发明还提供一种试剂盒,包括如权利要求3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物。

另外,本发明还提供所述的试剂盒在诊断前列腺癌、前列腺癌预后复发或前列腺癌临床分期中的用途。

另外,本发明还提供抑制lncrnahoxd-as1基因表达的sirna,所述sirna选自sirna1或sirna2,其中:所述sirna1序列如seqidno:5所示,所述sirna2的序列如seqidno:6所示。

另外,本发明还提供所述的sirna在制备用于治疗前列腺癌的药物制剂中的应用。

另外,本发明还提供一种药物制剂,所述药物制剂包括如权利要求7所述的sirna。

另外,本发明还提供所述的药物制剂在治疗前列腺癌中的用途。

本发明的有益效果在于:本发明提供lncrnahoxd-as1在前列腺癌诊断和药物治疗中的应用,鉴于lncrnas在前列腺癌中的重要性,我们通过基因芯片筛选出前列腺癌去势抵抗相关的基因lncrnahoxd-as1;通过对tcga数据库分析发现lncrnahoxd-as1在高分期、gleason评分、淋巴结转移的前列腺癌病例中高表达,与无进展生存预后呈负相关,是诊断前列腺癌生存预后的独立指标;通过体内外功能实验发现沉默lncrnahoxd-as1能够抑制前列腺癌细胞的增殖、去势抵抗及化疗耐药;以上结果表明lncrnahoxd-as1是前列腺癌的一个重要致癌因子,可作为前列腺癌预后诊断的分子标记物和治疗的新靶点。

附图说明

图1为实施例1中筛选前列腺癌去势抵抗相关的lncrnas;其中,图1a通过基因芯片检测激素依赖性前列腺癌细胞株lncap与激素非依赖性前列腺癌细胞株lncap-bic和lncap-ai中差异表达的lncrnas;图1b通过实时定量pcr检测芯片中上调倍数较高的lncrnas;图1crna-fish检测lncrnahoxd-as1的亚细胞定位,图中标尺为10μm。

图2为实施例2中kaplan-miere生存分析对hoxd-as1高/低表达组的前列腺癌病例的无进展生存期进行分析;

图3为实施例3中沉默lncrnahoxd-as1的表达能抑制前列腺癌细胞的增殖;其中,图3a使用qpcr在lncap、lncap-bic,lncap-ai和pc-3细胞中检测lncrnahoxd-as1的干扰效率;图3b利用mts检测在lncap和pc-3细胞中敲低lncrnahoxd-as1对其在普通培养基中的增殖能力的影响;图3c利用mts检测在lncap、lncap-bic和lncap-ai细胞中敲低lncrnahoxd-as1对其在去除雄激素培养基中的增殖能力的影响;图3d敲低lncrnahoxd-as1对lncap和pc-3细胞克隆形成能力的影响;*表示p<0.05,**表示p<0.01;

图4为实施例4中沉默lncrnahoxd-as1的表达能增强前列腺癌细胞对去势治疗药物的敏感性;其中,图4a在lncap、lncap-bic、lncap-ai细胞株中敲低lncrnahoxd-as1后,通过mts检测细胞对比卡鲁胺的敏感性;图4b敲低lncrnahoxd-as1后,比卡鲁胺ic50的变化,ic50以平均值±标准差来表示;*表示p<0.05,**表示p<0.01;

图5为实施例4中沉默lncrnahoxd-as1的表达能增强前列腺癌细胞对体外紫杉醇化疗的敏感性;其中,图5a通过mts检测在lncap、lncap-bic、lncap-ai以及pc-3细胞中敲低lncrnahoxd-as1对紫杉醇敏感性的影响;图5b敲低lncrnahoxd-as1后,紫杉醇ic50的变化,ic50以平均值±标准差来表示;*表示p<0.05,**表示p<0.01;

图6为实施例4中沉默lncrnahoxd-as1能增加紫杉醇诱导前列腺癌细胞的凋亡率;其中,图6a在lncap、lncap-bic、lncap-ai以及pc-3细胞中沉默lncrnahoxd-as1后,通过流式细胞术检测细胞凋亡比例,dmso为对照组,ptx为紫杉醇处理组;图6b流式细胞术检测凋亡细胞比例统计,比例以平均值±标准差来表示;*表示p<0.05,**表示p<0.01。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例、附表和附图对本发明作进一步说明。

本申请中提及的细胞株、lncrna表达谱芯片及实验试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得,它们仅做举例,对本发明不是唯一的,可分别用其他适合的工具和生物材料来代替。

实施例1鉴定前列腺癌去势抵抗相关基因lncrnahoxd-as1

前列腺癌细胞培养

前列腺癌细胞株lncap和pc-3购于美国模式培养物集存库(atcc),lncap使用rpmi-1640培养基进行培养,pc-3使用f12k培养基进行培养。培养基中均含有10%的胎牛血清、50u/ml青霉素和50μg/ml链霉素。在做雄激素相关实验前,lncap应在含10%炭吸附血清的无酚红rpmi-1640中预处理48~72h,以完全除去激素的影响。

去势抵抗前列腺癌细胞株的构建

使用两种方法,在lncap细胞的基础上构建去势抵抗前列腺癌的细胞株

1)使用无酚红1640培养基,10%普通胎牛血清,在培养基中添加终浓度为20μm的比卡鲁胺,连续传代12个月(约48~50代),建立lncap-bic细胞;

2)使用无酚红1640培养基,10%炭吸附血清,连续传代12个月(约48~50代),建立lncap-ai细胞;

去势抵抗前列腺癌细胞株lncap-bic使用无酚红rpmi-1640,含10%胎牛血清,添加浓度为20μm的比卡鲁胺(bicalutamide),lncap细胞使用无酚红rpmi-1640,含10%炭吸附胎牛血清。培养基中均添加50u/ml青霉素和50μg/ml链霉素。

lncrna表达谱芯片

准备lncap、lncap-bic和lncap-ai细胞,细胞处于对数生长期后使用trizol进行裂解,抽提rna进行质量鉴定,质检合格的rna按照用博奥生物芯片通用标记试剂盒标记方法对rna进行扩增、转录生成荧光标记的crna;标记后的样品杂交于博奥生物有限公司公司(中国,北京)的晶芯lncrna+mrna表达谱芯片(4×180k)上,杂交、漂洗后由agilentscannerg2565ca扫描仪进行扫描;原始数据分析由agilentfeatureextractionsoftware(version10.7.3.1)软件完成。差异基因的标准为表达改变≥2倍。

如图1a所示,雄激素依赖型细胞lncap、雄激素非依赖型细胞lncap-bic和lncap-ai细胞中的lncrna的表达存在差异。

rna提取及逆转录-实时荧光定量pcr实验

总rna提取:弃去培养基,pbs洗2次,6孔板每孔细胞加入1mltrizol裂解液,反复吹打混匀使细胞充分裂解,并在室温静置10~15min,然后将裂解液转移至1.5mlep管中。加入1/5体积的氯仿,剧烈振荡混匀,室温下静置至出现分层。12000rpm,4℃离心15min,此时ep管中的溶液分为三层,小心将最上层上清液(约400~500μl)转移至新的无rna酶ep管,注意不要触及中间相和沉淀。沉淀rna:加入与上清等体积的异丙醇(约400~500μl),充分混匀后室温静置10min。4℃,12000rpm离心10min后弃去上清,得到rna沉淀。加入75%乙醇1ml洗涤1次,4℃7500rpm离心5min,充分弃去乙醇,晾干至rna完全变成透明。根据沉淀大小加入适量depc处理水,充分震荡混匀。rna浓度和纯度检测:使用nanodrop2000spectrophotometer,首先用depc处理水调零,加入1μlrna样品检测其浓度和纯度;如果od260/od280在

1.9~2.1,说明rna质量好,无蛋白质污染;如果od260/od280小于1.8,则表明rna中存在蛋白质污染。

逆转录:采用逆转录试剂primerscriptrt-pcrkit(takara)进行。在无rnase的200μlpcr管中配制以下体系如表1所示:

表1

上述溶液混匀后放入pcr仪中,温度设定为:37℃15min;85℃5s进行逆转录。产物用depc水稀释10倍后可用于后续pcr实验,可长期保存于-30℃。

荧光定量pcr:本实验采用roche的sybrgreenpcrkit,bio-radcfxconnectreal-timesystem进行荧光定量pcr实验。gapdh为内参,定量方法选用2-δδct法。配制定量pcr体系如表2所示。实验步骤:1)配总管:包括sybrgreen,水,上下游引物、充分混匀;2)总管内试剂加入96孔板中,每孔8μl;3)稀释后充分混匀的cdna,每孔2μl;4)贴膜,离心,上机。反应条件:95℃预变性5min;45个扩增循环:95℃变性15s,56℃脱火15s,72℃延伸15s;72℃保持7min;溶解曲线:温度为55~95℃,1次/min。

表2

lncrnahoxd-as1引物为:primerf(seqidno:3):acctgcctctactactgcaaa,primerr(seqidno:4):gcaaagacaatataagggccc;以此检测hoxd-as1的表达量。如图1b所示,雄激素依赖型细胞lncap、雄激素非依赖型细胞lncap-bic和lncap-ai细胞中的lncrnahoxd-as1的表达存在差异。

rna荧光原位杂交(rna-fish)

细胞培养:将细胞接种在共聚焦显微镜专用的10~15mm小皿中,实验前使细胞汇合度达到50%~60%。细胞固定与通透:(1)1×pbs清洗细胞5min,1次;(2)4%多聚甲醛室温固定10min;(3)1×pbs清洗细胞共3次,每次5min;(4)每孔加入1ml预冷的0.5%tritonx-100的pbs,4℃静置10min;(5)弃去通透液后,加入1×pbs清洗细胞3次,每次5min。探针杂交:(1)每孔加入200μl预杂交液,37℃预杂交30min;(2)预杂交期间,将杂交液在37℃预热;(3)避光,分别把2.5μl20μmhoxd-as1fish探针储存液、2.5μl内参u6和18sfish探针储存液加入到150μl杂交液中,充分混匀;(4)弃去预杂交液,加入150μl含有探针的杂交液,避光,37℃杂交过夜,注意保持杂交环境湿润;(5)避光,42℃,4×ssc,0.1%tween-20洗涤细胞3次,每次5min;(6)避光,42℃,2×ssc洗涤细胞1次;(7)避光,42℃,1×ssc洗涤细胞1次;(8)避光,1×pbs洗涤细胞,室温摇动5min。dna染色、封片和拍照:(1)避光,dapi染色液染色1min;(2)避光,1×pbs清洗细胞3次,每次5min;(3)彻底弃去pbs,滴加80μl荧光抗淬灭封片剂;(4)在荧光共聚焦显微镜63倍油镜下拍照。

lncrnahoxd-as1特异性探针(如seqidno:2所示):cgcatctctatttggtttga;以此检测lncrnahoxd-as1在细胞中的表达量和亚细胞定位。如图1c所示,lncrnahoxd-as1主要表达在前列腺癌细胞的胞核位置。

实施例2高表达的lncrnahoxd-as1与前列腺癌的肿瘤分期、gleason评分、淋巴结转移和不良预后显著相关

lncrnahoxd-as1在tcga中前列腺癌患者的表达值数据来源于tanric(http://ibl.mdanderson.org/tanric/_design/basic/query.html),对应患者的临床信息来自于tcga网站https://cancergenome.nih.gov/,获得了374例前列腺癌患者的临床病理信息,具体见表3。

表3tcga中前列腺癌患者的临床病理信息

排除没有对应临床数据的病例,lncrnahoxd-as1表达水平与前列腺癌临床病理特征的相关性分析使用χ2检验,与总体生存率相关性分析使用log-rank检验,对生存影响的多因素分析使用cox回归分析,所有统计分析使用spss19.0软件,结果见图2,表4和表5。

如图2所示,lncrnahoxd-as1表达水平较高的前列腺癌患者存活率相对较低;如表4和表5所示,高分期、高gleason评分和有淋巴结转移的前列腺癌患者中均高表达,高水平表达的lncrnahoxd-as1是前列腺癌无进展生存的独立预测因素,检测lncrnahoxd-as1的表达可作为诊断前列腺癌进展的标记物。

表4

hoxd-as1表达水平与前列腺癌临床病理特征的关系分析

*p<0.05认为是有统计学差异。相应临床信息缺乏的患者被排除对应的相关性分析。

表5

hoxd-as1表达水平与前列腺癌生存预后的单、多因素分析

cox风险回归模型,单变量分析与生存相关的变量有统计学差异的,进一步采用多变量分析。显著性

p值以粗体字显示。hr>1表示死亡风险增加;hr<1表示死亡风险减少。

实施例3沉默hoxd-as1抑制前列腺癌细胞的增殖。

细胞sirna转染

由上海吉玛合成小干扰rna(sirna),寡核苷酸序列如下:

si-hoxd-as1-1:5’-gcccuuucugaccugcuua-3’,如seqidno:5;si-hoxd-as1-2:5’-gaaagaaggaccaaaguaa-3’,如seqidno:6。用rnaimaxreagent试剂将sirna转染到前列腺癌细胞株pc-3、lncap、lncap-bic、lncap-ai细胞中,sirna转染终浓度为75nm。具体步骤如下:

1)铺板:转染前24h,消化细胞,离心,重悬,计数。将细胞接种于6孔板中,每孔含完全培养基1.5ml,使转染前细胞汇合度达到50%~60%;

2)转染:将150pmol的sirna加入125μlopti-memi培养基中,震荡混匀;

3)吸取lipofectaminernaimaxreagent5μl加入另一份125μlopti-mem培养基中混匀;

4)将上述两管液体震荡混匀,室温放置约15min;

5)将6孔板的培养基换为1ml完全培养基,上述250μl混合物加入上述6孔板中,液体总量为1250μl,sirna浓度为75nm,加入后轻轻摇匀;

6)放置37℃,5%co2培养箱,第二天换液1次;继续孵育24~72h后进行后续实验;通过实时荧光定量pcr检测hoxd-as1被抑制的效率,结果见图3a所示。

mtt实验

将转染或处理过的细胞用胰酶消化,离心,重悬,计数。lncap及其去势抵抗细胞株每孔4×103,pc-3每孔2×103个细胞,100μl培养基接种于96孔板内,每组3-5个复孔,并另外设置1个只含培养基空白对照孔。加入mts试剂20μl,避光继续培养2~4h。酶标仪(490nm波长)测每孔的od值。每24h进行一次测量,总共6d。根据od值绘制细胞增殖曲线,结果见图3b和3c。

克隆形成实验

前列腺癌细胞株lncap和pc-3细胞转染、消化、离心、重悬、计数同前。制成单细胞悬液,每种细胞均以250或500个/孔接种于96孔板中,每孔含200μl完全培养基培养,放入培养箱培养7~10d。7-10d后小心吸去培养基,多聚甲醛固定30min,然后用0.1%的结晶紫溶液(溶于纯水中)染色30min,用纯水冲洗干净,晾干。在40倍光学显微镜下拍摄图片用于计数和统计,结果见图3d。

如图3a、3b、3c和3d所示,通过sirna在前列腺癌细胞中沉默lncrnahoxd-as1表达后,能抑制前列腺癌细胞的增殖。

实施例4沉默lncrnahoxd-as1增加前列腺癌细胞对去势治疗药物比卡鲁胺和化疗药物紫杉醇的敏感性和疗效

去势疗药物比卡鲁胺和化疗药物紫杉醇的敏感性实验

将转染或处理过的细胞用胰酶消化,离心,重悬,计数。lncap及其去势抵抗细胞株每孔1×104,pc-3每孔5×103个细胞,100μl培养基接种于96孔板内,每组3~5个复孔,并另外设置1个只含培养基空白对照孔。一组分别给予0、10、20、40、60和100μm的比卡鲁胺(sigma,st.louis,mi,usa)处理120h,另一组分别给予0、5、10、20、50和100nm的紫杉醇(selleck,houston,tx,usa)处理18h,加入mts试剂20μl,避光继续培养2~4h。酶标仪(490nm波长)测每孔的od值。根据细胞存活率绘制细胞药物抑制曲线,结果见图4-5。

如图4和5所示,通过sirna在前列腺癌细胞中沉默lncrnahoxd-as1表达后,能增加前列腺癌细胞对去势治疗药物比卡鲁胺(bicalutamide)和化疗药物紫杉醇(paclitaxel,ptx)的敏感性和疗效。

流式细胞术检测细胞凋亡

加化疗药前1d,按3~4×105/孔将转染后细胞接种于6孔板。加入紫杉醇(paclitaxel)使终浓度为5nm,同时设空白对照组不加药。48h后收集上清及贴壁的细胞,用pbs洗2遍。加入100μlbindingbuffer重悬细胞。加入5μlannexinv和5μlpi双染,充分混匀,室温避光孵育20min。流式细胞仪facscaliberbdflowcytometer检测,ex/em=488/530nm,结果见图6。

如图6所示,通过sirna在前列腺癌细胞中沉默lncrnahoxd-as1表达后,能增加紫杉醇诱导前列腺癌细胞凋亡的数目。

实施例5沉默lncrnahoxd-as1增加前列腺癌细胞对体内紫杉醇化疗的敏感性和疗效

动物实验获得中山大学动物伦理委员会的批准,在中山大学南校区实验动物中心屏障环境内进行。pc-3si-ctrl和pc-3si-hoxd-as1细胞消化和使用pbs洗2次后进行计数,每只小鼠予3.5×106个细胞皮下注射,两组细胞各注射10只小鼠。注射前将细胞与等体积matrigel混合均匀后皮下接种到裸鼠的左背部。大约一周后可在皮下触及肿瘤小结节,此时开始隔天测量肿瘤长度、宽度和高度,并随机将注射si-ctrl和si-hoxd-as1各分为2组,对照组接受pbs,实验组接受紫杉醇化疗。实验组于第9,12,15,21,24,27天时给予5mg/kg体重的紫杉醇腹腔灌注化疗,对照组则灌注等量的pbs。到第30d时使用颈椎脱臼处死裸鼠后,取出皮下肿瘤,并拍照、称重、记录。

实验结果显示,通过sirna在前列腺癌细胞中沉默lncrnahoxd-as1表达后,能增加紫杉醇抑制小鼠负荷的肿瘤生长。

最后所应当说明的是,以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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