一种里氏木霉工程菌及其制备方法与应用与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种里氏木霉工程菌及其制备方法与应用。

背景技术：

里氏木霉(trichodermareesei)具有生物安全性高和易于培养的优点，其胞外纤维素酶系统由60％～80％的外切葡聚糖苷酶，20％～36％的内切葡聚糖苷酶和1％的β-葡萄糖苷酶组成，这些酶协同作用，将纤维素转换成葡萄糖。里氏木霉具有良好的安全性，已长期应用于食品加工业，是公认的gras(generallyregardedassafe)菌和美国fda认证的食品安全菌株。同时，里氏木霉的发酵工艺成熟、发酵成本低，为其投入工业化生产奠定了良好的基础，但里氏木霉自身并不能分泌表达葡萄糖氧化酶。

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，god)的系统名称为β-d-葡萄糖:氧1-氧化还原酶(ec1.1.3.4)，可从许多来源的真菌中分离、纯化得到，这些真菌主要为曲霉和青霉属，其中用来生产god的主要是黑曲霉。god能够催化β-d-葡萄糖被分子氧氧化生成葡萄糖酸-δ-内酯，并生成过氧化氢。生成的葡萄糖-δ-内酯随后自发水解或者在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶具有广泛的应用价值，可用于葡萄糖生物传感器制造(测血糖等)、作为面粉添加剂替代溴酸钾、生产葡萄糖酸及其盐、制备生物燃料电池及饲料添加剂等领域。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种产葡萄糖氧化酶的里氏木霉，所述里氏木霉含有葡萄糖氧化酶的编码基因god。

所述葡萄糖氧化酶的编码基因god是通过表达载体导入所述里氏木霉的；

所述葡萄糖氧化酶的编码基因god来源于黑曲霉；再具体的，所述葡萄糖氧化酶的编码基因god的核苷酸序列为序列表中seqid№：2第26-1896位核苷酸序列。

具体的，所述里氏木霉还过表达内源的与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1。

所述过表达包括通过表达载体将所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1导入所述里氏木霉的

所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1来源于里氏木霉；再具体的，所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1的核苷酸序列为序列表中seqid№：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸。

具体的，所述里氏木霉含有重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t；和/或所述里氏木霉含有重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t；

所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t为将序列表中seqid№：1所示核苷酸序列的第38-1787位核苷酸、seqid№：2所示核苷酸序列的第26-1896位核苷酸、seqid№：3所示核苷酸序列的第26-1525位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的；

所述重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t为将序列表中seqid№：5所示核苷酸序列的第26-1521位核苷酸、seqid№：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸、和seqid№：7所示核苷酸序列的第26-1025位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的。

具体的，所述产葡萄糖氧化酶的里氏木霉为含有所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t的重组菌；或，所述产葡萄糖氧化酶的里氏木霉为含有所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t和所述重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t的重组菌。

本发明的还一个目的是提供一种可产葡萄糖氧化酶的里氏木霉的制备方法，所述方法包括：将葡萄糖氧化酶的编码基因god导入所述里氏木霉。

所述葡萄糖氧化酶的编码基因god来源于黑曲霉；再具体的，所述葡萄糖氧化酶的编码基因god的核苷酸序列为序列表中seqid№：2第26-1896位核苷酸序列。

所述方法还包括将内源的与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1导入所述里氏木霉。

所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1来源于里氏木霉；再具体的，所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1的核苷酸序列为序列表中seqid№：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸。

所述导入包括将重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t导入所述里氏木霉；和/或所述导入还包括将重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t导入所述里氏木霉；

所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t为将序列表中seqid№：1所示核苷酸序列的第38-1787位核苷酸、seqid№：2所示核苷酸序列的第26-1896位核苷酸、seqid№：3所示核苷酸序列的第26-1525位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的；

所述重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t为将序列表中seqid№：5所示核苷酸序列的第26-1521位核苷酸、seqid№：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸、和seqid№：7所示核苷酸序列的第26-1025位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的。

本发明的还一个目的是提供一种葡萄糖氧化酶的制备方法，所述方法包括下述1)-3)至少一种：

1)将葡萄糖氧化酶的编码基因god导入所述里氏木霉；

所述葡萄糖氧化酶的编码基因god来源于黑曲霉；再具体的，所述葡萄糖氧化酶的编码基因god的核苷酸序列为序列表中seqid№：2第26-1896位核苷酸序列；

2)所述方法还包括将内源的与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1导入所述里氏木霉；

所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1来源于里氏木霉；再具体的，所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1的核苷酸序列为序列表中seqid№：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸；

3)使里氏木霉表达导入的编码基因即得。

所述导入包括将重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t导入所述里氏木霉；和/或所述导入还包括将重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t导入所述里氏木霉；

所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t为将序列表中seqid№：1所示核苷酸序列的第38-1787位核苷酸、seqid№：2所示核苷酸序列的第26-1896位核苷酸、seqid№：3所示核苷酸序列的第26-1525位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的；

所述重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t为将序列表中seqid№：5所示核苷酸序列的第26-1521位核苷酸、seqid№：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸、和seqid№：7所示核苷酸序列的第26-1025位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的。

本发明的又一个目的是提供一种重组质粒，所述质粒包括下述1)或2)：

1)所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t为将序列表中seqid№：1所示核苷酸序列的第38-1787位核苷酸、seqid№：2所示核苷酸序列的第26-1896位核苷酸、seqid№：3所示核苷酸序列的第26-1525位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的；

2)所述重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t为将序列表中seqid№：5所示核苷酸序列的第26-1521位核苷酸、seqid№：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸、和seqid№：7所示核苷酸序列的第26-1025位核苷酸插入prs424质粒的ecori酶切位点后获得的；

本发明的再一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌包括含有所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t的里氏木霉重组菌；或含有所述重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t和所述重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t的里氏木霉重组菌。

本发明的最后一个目的是提供本发明任一所述里氏木霉、任一所述方法、所述重组质粒、重组菌在下述1)-4)中至少一种中的应用：

1)制备葡萄糖氧化酶和/或提高葡萄糖氧化酶产量中的应用；

2)在制备葡萄糖氧化酶和/或提高葡萄糖氧化酶产量的相关产品中的应用；

3)在提高里氏木霉的葡萄糖氧化酶的表达量中的应用；

4)在制备提高里氏木霉的葡萄糖氧化酶的表达量的相关产品中的应用。

里氏木霉本身并不分泌表达葡萄糖氧化酶，本发明将外源的来自黑曲霉的、具有较好ph耐受性的葡萄糖氧化酶基因(god)转化入里氏木霉并将其表达，得到可表达外源葡萄糖氧化酶的转化子tu6god，再在该转化子中过表达内源的与蛋白分泌到胞外相关的蛋白基因(snc1)，从而筛选到一株葡萄糖氧化酶的活性比出发菌株酶活显著提高的转化子tu6god-snc。

tu6god转化子在mm-avicel中培养32h后，其葡萄糖氧化酶酶活达到0.28u/ml；而tu6god-snc在mm-avicel中培养44h后，其葡萄糖氧化酶酶活达到了0.61u/ml，相较于tu6god，其god酶活提高了121％。出发菌株tu-6中，不能测定到葡萄糖氧化酶酶活。

附图说明

图1为表达葡萄糖氧化酶的重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t的质粒图谱。

图2为pcr鉴定prs424-cbh1p-god-cbh1t质粒是否转入里氏木霉中的结果图，图中m代表dna分子量，序号11表示tu-6出发菌株，序号1-10表示实施例所制备得到的tu6god各个转化子。

图3为表达囊泡融合细胞膜相关蛋白的重组质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t的质粒图谱。

图4为pcr鉴定prs424-pdc1p-snc1-pdc1t质粒是否转入里氏木霉重组菌株tu6god中的结果图，图中m代表dna分子量，序号13表示tu-6出发菌株，序号1-12表示实施例所制备得到的tu6god-snc各个转化子。

图5为tu6god和tu6god-snc转化子之间葡萄糖氧化酶酶活的比较结果图。

图6为出发菌株及各转化子摇瓶发酵液的纤维素酶酶活测定结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述mm培养基的成分包括：(nh4)2so4，5.0g/l；kh2po4，15.0g/l；mgso4·7h2o，0.6g/l；cacl2·2h2o，0.6g/l；cocl2·6h2o，0.0037g/l；feso4·7h2o，0.005g/l；znso4·7h2o，0.0014g/l；mnso4·h2o，0.0016g/l；葡萄糖(或avicel等碳源)，20g/l；所用溶剂为水。

实施例1.表达葡萄糖氧化酶的重组质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t的构建

(一)cbh1启动子的扩增

以里氏木霉tu-6的基因组dna为模板，以trcbh1pf、trcbh1pr为引物对，对cbh1启动子进行pcr扩增。

trcbh1pf的核苷酸序列为：

5'–cgtaatacgactcactatagggcgaattggcggccgcgggtttggagcaatgtgggac-3'

trcbh1pr的核苷酸序列为：

5'-agatgacggccaacttccgatacatagcacgagctgtggccaagaaggcc-3'

pcr反应体系为：

pcr反应条件为：95℃×5min预变性；94℃×30s，55℃×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。在1％琼脂糖胶上电泳，切下pcr产物中的目的条带，纯化dna。

将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的cbh1启动子具有序列表中seqid№：1的核苷酸序列，共1812bp。

(二)god基因的扩增

以黑曲霉的基因组dna为模板，以godf和godr为引物对，对god基因片段进行扩增。

godf的核苷酸序列为：

5'-ggccttcttggccacagctcgtgctatgtatcggaagttggccgtcatct-3'

godr的核苷酸序列为：

5'-tgcgtcaggctttcgccacggagctctagggctcaccaagaatctaccgg-3'

pcr反应体系为：

pcr反应条件为：95℃×5min；94℃×30s，55c×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。在1％琼脂糖胶上电泳，切下pcr产物中的目的条带，纯化dna。

将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的god基因片段具有序列表中seqid№：2的核苷酸序列，共1921bp。

(三)cbh1终止子的扩增

以里氏木霉tu-6的基因组dna为模板，以trcbh1tf和trcbh1tr为引物对，对cbh1基因终止子进行扩增。

trcbh1tf的核苷酸序列为：

5'-ccggtagattcttggtgagcccgtaagctccgtggcgaaagcctgacgca-3'

trcbh1tr的核苷酸序列为：

5'-ttaaccctcactaaagggaacaaaagctggcggccgcaacacttcggtggaggtgtcg-3'

pcr体系为：

pcr反应条件为：95℃×5min；94℃×30s，55℃×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。在1％琼脂糖胶上电泳，切下pcr产物中的目的条带，纯化dna。

将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的cbh1终止子具有序列表中seqid№：3的核苷酸序列，共1562bp。

(四)prs424-cbh1p-god-cbh1t质粒的构建

将prs424质粒用ecori酶切，电泳、回收线性化质粒载体。将其和上述制备的cbh1启动子、god基因片段和cbh1终止子的dna片段按1:3:3:3的摩尔比，用氯化锂法共同转化酿酒酵母ah109的感受态细胞，涂布在sd-trp培养基上，30℃静置培养48h。由于在引物设计时，加入了末端的互补序列(overlap区，重叠区)，因此prs424和这三个外源片段可以通过酿酒酵母的体内重组无缝拼接起来。对平板上长出的酵母菌落做菌落pcr，以鉴定三个片段是否已经连接到prs424上。将pcr鉴定为阳性的酵母菌落挑取并接种于3mlypd培养基上，30℃、180rpm培养过夜，提取质粒。将重组质粒转化大肠杆菌trans1感受态细胞(购自全式金公司)，涂布于含100g/ml的lb琼脂平板上，37℃静置培养16h。挑取单克隆菌落，接种于3mllb培养基(含100g/ml氨苄)中，37℃、180rpm振摇培养过夜，提取质粒，备用于转化。

测序验证序列的正确性。所得质粒中插入的外源基因的序列依次为seqid№：1第38-1787位核苷酸，seqid№：2第26-1896位核苷酸，seqid№：3第26-1525位核苷酸，将该质粒命名为prs424-cbh1p-god-cbh1t，所绘质粒图谱如图1所示。

本发明构建的prs424-cbh1p-god-cbh1t质粒，经转入里氏木霉中，在cbh1启动子的驱动下，转录出mrna，并翻译成葡萄糖氧化酶god。

实施例2.将prs424-cbh1p-god-cbh1t质粒转化入里氏木霉

(一)pyr4基因表达盒dna的准备

以里氏木霉qm9414(购自美国atcc菌种保藏中心)的基因组dna为模板，pcr扩增pyr4基因表达盒。

所用引物为：

ppyr4f：5’-gactgacccccccggttgggcccc-3’

ppyr4r：5’-cgatatcaagcttatcgatcaactgca-3’

pcr反应体系如下：

pcr反应条件为：95℃×5min；94℃×30s，55℃×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。在1％琼脂糖胶上电泳，切下pcr产物中的目的条带，纯化dna。

将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的pyr4基因表达盒具有序列表中seqid№：4的核苷酸序列，共2919bp。

(二)里氏木霉tu-6(在atcc菌种库的收藏号为atccmya-256)的转化

将里氏木霉tu-6接种于土豆培养基(pda)。平板上，30℃静置培养7d待其产孢，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的pdb培养基。在30℃、180rpm振摇培养过夜。在12层纱布上过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的lysingenzymes(购自sigma公司)，在30℃消化1-2小时。收集原生质体，将上述制备的prs424-cbh1p-god-cbh1t质粒与pyr4基因表达盒dna按2:1的摩尔比混合后，以peg介导的原生质体转化法将上述两种dna同时转入里氏木霉tu-6菌株。

实施例3.重组转化子tu6god的筛选

转化子在含1m山梨醇的mm-glucose琼脂培养基上生长、选择。挑取单个克隆，接种于25ml液体mm-glucose中，30℃、180rpm振摇培养1d。提取基因组dna，通过pcr验证prs424-cbh1p-god-cbh1t质粒是否已经成功转化进入里氏木霉细胞。

pcr所用引物为：

yz-godf：5’-tgctcccctttacccgcggctatg-3’

yz-trchb1tr：5’-tctccagtgaaagatgagttgacc-3’

pcr反应体系如下：

pcr反应条件为：95℃×5min；94℃×30s，55℃×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。

将上述pcr产物在1％琼脂糖胶上电泳，结果如图2所示，有9个转化子(1、2、3、5、6、7、8、9、10)出现和预期一致大小即670bp的dna条带。因此，这些转化子是有prs424-cbh1p-god-cbh1t质粒转入的阳性转化子。提取阳性转化子的质粒送去测序，将测序正确的含有质粒prs424-cbh1p-god-cbh1t的阳性转化子命名为tu6god。

将上述tu6god转化子接种于pda培养基上，30℃静置培养7d产孢，收集孢子备用。

实施例4.表达里氏木霉来源蛋白分泌相关蛋白snc的重组质粒的构建

(一)pdc1启动子的扩增

以里氏木霉tu-6的基因组dna为模板，对pdc1启动子进行pcr扩增，pcr扩增引物为：

trpdc1pf：

5'-tatcgataagcttgatatcgaattcgtgtcgagccgggaggagttttcgc-3'

trpdc1pr：

5'-agggatcgtacggagcgtcggccatgattgtgctgtagctgcgctgcttt-3'

pcr体系为：

pcr反应条件为：95℃×5min预变性；94℃×30s，55℃×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。在1％琼脂糖胶上电泳，切下pcr产物中的目的条带，纯化dna。

将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的pdc1启动子具有序列表中seqid№：5的核苷酸序列，共1546bp。

(二)snc1基因的扩增

以里氏木霉的基因组dna为模板，对snc1基因片段进行pcr扩增，pcr扩增引物为：

sncf：

5'-aaagcagcgcagctacagcacaatcatggccgacgctccgtacgatccct-3'

sncr：

5'-ctacccggtcagacttcatgccgggttaacgggtggcaacgactgtggtt-3'

pcr体系为：

pcr反应条件为：95℃×5min；94℃×30s，55c×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。在1％琼脂糖胶上电泳，切下pcr产物中的目的条带，纯化dna。

将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的snc1基因片段具有序列表中seqid№：6的核苷酸序列，共725bp。

(三)pdc1终止子的扩增

以里氏木霉的基因组dna为模板，对pdc1终止子进行pcr扩增，pcr扩增引物为：

trpdc1tf：

5'-aaccacagtcgttgccacccgttaacccggcatgaagtctgaccgggtag-3'

trpdc1tr：

5'-ctctagaactagtggatcccccgggcgtcggccgggtggtgagcttctga-3'

pcr体系为：

pcr反应条件为：95℃×5min；94℃×30s，55℃×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。在1％琼脂糖胶上电泳，切下pcr产物中的目的条带，纯化dna。

将pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，上述pcr扩增得到的pdc1终止子具有序列表中seqid№：7的核苷酸序列，共1050bp。

(四)prs424-pdc1p-snc1-pdc1t质粒的构建

将prs424质粒用ecori酶切，电泳、回收线性化质粒载体。将其和上述制备得到的pdc1启动子、snc1基因片段和pdc1终止子的dna片段按1:3:3:3的摩尔比，用氯化锂法共同转化酿酒酵母ah109的感受态细胞，涂布在sd-trp培养基上，30℃静置培养48h。由于在引物设计时，加入了末端的互补序列，因此prs424和这三个外源片段可以通过酿酒酵母的体内重组无缝拼接起来对平板上长出的酵母菌落做菌落pcr，以鉴定三个片段是否已经连接到prs424上。将pcr鉴定为阳性的酵母菌落挑取并接种于3mlypd培养基上，30℃、180rpm培养过夜，提取质粒。将重组质粒转化大肠杆菌trans1感受态细胞，涂布于含100g/ml的lb琼脂平板上，37℃静置培养16h。挑取单克隆菌落，接种于3mllb培养基(含100g/ml氨苄)中，37℃、180rpm振摇培养过夜，提取质粒，备用于转化。

测序验证序列的正确性。所得质粒中插入的外源基因的序列依次为seqid№：5第26-1521位核苷酸，seqid№：6第26-700位核苷酸，seqid№：7第26-1025位核苷酸，将该质粒命名为prs424-pdc1p-snc1-pdc1t，所绘质粒图谱如图3所示。

本发明构建的prs424-pdc1p-snc1-pdc1t质粒，经转入上述实施例3所述的里氏木霉转化子tu6god中，在pdc1启动子的驱动下，转录出mrna，并翻译成snc蛋白。

实施例5.将prs424-pdc1p-snc1-pdc1t质粒转化入里氏木霉重组菌株tu6god

(一)里氏木霉重组菌株tu6god的转化

将上述实施例3所述的tu6god接种于土豆培养基(pda)平板上，30℃静置培养7d待其产孢，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的pdb培养基中，30℃、180rpm振摇培养过夜。在12层纱布上过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的lysingenzymes(购自sigma公司)，在30℃消化1-2小时。收集原生质体，将上述制备的prs424-pdc1p-snc1-pdc1t质粒与含有hph基因表达盒的prlmex30质粒(robertl.machetal.,transformationoftrichodermareeseibasedonhygromycinbresistanceusinghomologousexpressionsignals,currentgenetics,1994,25(6):567–570)dna按2:1的摩尔比混合后，以peg介导的原生质体转化法将上述两种dna同时转入上述实施例3所述的里氏木霉tu6god重组菌株。

实施例6.重组转化子tu6god-snc的筛选

转化子在含1m山梨醇的mm-glucose琼脂培养基上生长、选择。挑取单个克隆，接种于25ml液体mm-glucose中，30℃、180rpm振摇培养1d。提取基因组dna，通过pcr验证prs424-pdc1p-snc1-pdc1t的质粒已经成功转化进入里氏木霉细胞。

pcr所用引物为：

yzpdc1pf：5’-agtctccatcacaaggagctt-3’

yzsncr：5’-gctttcgcactcggtttgcgc-3’

pcr反应体系如下：

pcr反应条件为：95℃×5min；94℃×30s，55℃×30s，72℃×1min，32个循环；72℃×10min；4℃保存。

将上述pcr产物在1％琼脂糖胶上电泳，结果如图4所示，有9个转化子(图4中编号为1、2、5、6、8、9、10、11、12出现目的条带)出现和预期一致大小即701bp的dna条带,。因此，这些转化子是有prs424-pdc1p-snc1-pdc1t质粒转入的阳性转化子。提取阳性转化子的质粒送去测序，将测序正确的含有质粒prs424-pdc1p-snc1-pdc1t的阳性转化子命名为tu6god-snc。

将这些转化子接种于pda培养基上，30℃静置培养7d产孢，收集孢子备用。

实施例7.tu-6，tu6god和tu6god-snc转化子的诱导培养和葡萄糖氧化酶酶活的测定

(一)诱导培养

将出发菌株tu-6、tu6god和tu6god-snc的各转化子的孢子，接种1×10⁷个于100mlmm-glucose培养基中。30℃、180rpm振摇培养32h。将菌丝用12层纱布过滤，收集菌丝并用大量无菌水冲洗，以去除残余的葡萄糖。

称取等量(500mg)的上述菌丝，接种于100mlmm-avicel液体培养基中，出发菌株和每个转化子均做3个平行。30℃、180rpm振摇培养20h以诱导葡萄糖氧化酶的生产。从第20h开始(发酵条件不变)，每12小时收集发酵液，储存于4℃冰箱备用。

(二)葡萄糖氧化酶酶活测定

1)葡萄糖氧化酶的制备

将每个时间段收集的2ml发酵液8000rpm离心取上清液。

2)酶活测定

葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖(β-d-glucose)生成葡萄糖酸和过氧化氢(h2o2)，利用生成过氧化氢氧化来启动辣根过氧化物酶(hrp)氧化显色底物abts或邻联茴香胺(o-dianisidine)，通过监测显色底物颜色的变化计算得到god的酶活。本实验中利用abts作为显色底物，室温反应3min，测定od420的变化，以单位时间(1min)氧化1/2μmolabts所需的酶量定义为一个酶活单位(1u)。酶活测定体系包括：1mmol/labts，5u/mlhrp，100mmol/lβ-d-glucose，200mmol/l磷酸缓冲液(ph6.5)，加入适当稀释(当酶标仪读值超过范围时，加水梯度稀释酶液，使得酶标仪读值在可读值范围)的god酶液启动反应。反应如下：

实验结果如图5所示，tu6god转化子在mm-avicel中培养32h后，其葡萄糖氧化酶酶活达到0.28u/ml；而tu6god-snc在mm-avicel中培养44h后，其葡萄糖氧化酶酶活达到了0.61u/ml，相较于tu6god，其god酶活提高了121％。出发菌株tu-6的葡萄糖氧化酶酶活未检测到。

实施例8.tu-6，tu6god和tu6god-snc转化子的诱导培养和纤维素酶酶活的测定

(一)诱导培养

将出发菌株tu-6，tu6god和tu6god-snc转化子的孢子，接种1×10⁷个于100mlmm-glucose培养基中。30℃、180rpm振摇培养1d。将菌丝用12层纱布过滤，收集菌丝并用大量无菌水冲洗，以去除残余的葡萄糖。

称取等量(500mg)的菌丝，接种于100mlmm-avicel液体培养基中，出发菌株和每个转化子均做3个平行。30℃、180rpm振摇培养68h以诱导纤维素酶的生产。从第20h开始，每12小时收集发酵液，储存于4℃冰箱备用。

(二)纤维素酶活测定

1)纤维素酶的提取

将每个时间段收集的2ml发酵液8000rpm离心取上清液。

2)酶活测定

对出发菌株tu-6和各转化子，经预实验测定酶活，发现在用纤维素诱导后第6天(68h)时纤维素酶的酶活最高。因此，对这些菌株，选取68h的发酵液，分别测定总体纤维素酶酶活(滤纸酶酶活)及各分解酶酶活，包括内切葡聚糖酶活(cmc酶活)和β-葡萄糖苷酶酶活(bg酶活)。

纤维素酶的滤纸酶活(fpaseactivity)采用whatman一号滤纸，参照iupac标准方法进行测定。滤纸酶活的单位定义为：1ml液体酶，在50℃、ph4.8的条件下，每小时水解滤纸底物，产生1mol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(u)。

内切葡聚糖酶活测定：以磷酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0，0.4m磷酸-0.2m柠檬酸钠)配制2％的中粘度羧甲基纤维素钠(cmc-na)作为底物进行测定。取酶液500μl，加入到500μlcmc-na中混合。50℃反应30min后，加入1.5mldns终止反应。在540nm处测定od值。cmc-na酶活的单位定义为：1ml液体酶，在50℃、ph4.8的条件下，每小时水解羧甲基纤维素钠，产生1mol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(u)。

β-葡萄糖苷酶酶活的测定：用pnpg(pnp-β-1,4-glucose)为底物，称取0.12gpnpg用蒸馏水定容到50ml，配成8mm的pnpg，使用前-20℃避光保存。反应体系：250μl2mmpnpg和250μl适当稀释的酶液，pnpg终浓度为1mm，振荡混匀。50℃水浴保温10min，迅速冷却，向各试管中加入1.5ml1mna2co3终止反应，再向空白管中中补加250μl酶液，混合均匀。以0号管为参比，测定405nm的吸光度。β-葡萄糖苷酶酶活的单位定义为：在50℃、ph5.0的条件下，1ml酶液每小时水解pnpg，产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(u)。

实验结果如图6所示，

重组菌tu6god和tu6god-snc与出发菌株tu-6相比，总纤维素酶活(滤纸酶活)和内切纤维素酶酶活(cmc-na酶活)都呈现下降，而β-葡萄糖苷酶(bg酶活)却有所提高。重组菌tu6god和tu6god-snc与tu-6相比，tu-6的滤纸酶活为39.00u/ml，而tu6god和tu6god-snc的酶活达到17.68u/ml和9.24u/ml；tu-6、tu6god和tu6god-snc内切纤维素酶活分别为10.97u/ml、5.82u/ml和3.65u/ml；tu6god和tu6god-snc的β-葡萄糖苷酶酶活为0.80u/ml和0.72u/ml而tu-6达到0.58u/ml。

上述实验结果表明过表达snc1能促进葡萄糖氧化酶的表达，但却使里氏木霉本身表达的纤维素酶分泌水平下降。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种里氏木霉工程菌及其制备方法与应用

<160>7

<210>1

<211>1812

<212>dna

<213>里氏木霉（trichodermareesei）

<400>1

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<210>2

<211>1921

<212>dna

<213>黑曲霉（aspergillusniger）

<400>2

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<210>3

<211>1562

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<213>里氏木霉（trichodermareesei）

<400>3

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<210>4

<211>2919

<212>dna

<213>里氏木霉（trichodermareesei）

<400>4

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<213>里氏木霉（trichodermareesei）

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<213>里氏木霉（trichodermareesei）

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<213>里氏木霉（trichodermareesei）

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