一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用两步重叠pcr法获取人体组织中myc基因的方法。

背景技术：

福尔马林固定石蜡包埋技术是临床病理诊断中使用最广泛的。在福尔马林固定石蜡包埋技术中，福尔马林作为固定剂，能够减小组织形态在一定时间内的变化，为后续的免疫组化、组织学分析及基因诊断等方面提供可靠的保障。

现有的福尔马林固定石蜡包埋技术仍存在如下缺陷：首先，标本中提取出的dna浓度较低、片段较短，随着时间的推移，标本的质量逐渐降低，使得获取完整的基因变得相当困难，而dna的片段化会导致目的基因缺失完整性，使得检测结果不可靠、数据拼接更困难，从而无法分析myc全长基因的单倍型信息，给临床检验与医学科学研究造成很大的障碍；其次，现有的石蜡包埋组织脱蜡方法中常采用二甲苯脱蜡法，但是二甲苯易污染环境、对人体有害，而且抽提过程较长；再次，目前获取目的dna片段的方法有pcr、酶切、基因芯片、杂交捕获等，但是获得的片段存在容易断裂、纯度与浓度较低、杂质较多、长度较短等问题，同时，普遍用于福尔马林固定石蜡包埋人体组织dna检测的二代测序法也存在着读长较短、测序深度太大以及对高gc区域、重复区域和碱基修饰区域不敏感等问题，使得信息拼接量较大，无法将myc基因测通，从而增加了长片段dna结果分析的难度。因此，急需建立一种从福尔马林固定石蜡包埋人体组织中获取高质量、高浓度及完整性较强的长片段目的基因的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种获取人体组织中myc基因的方法，利用tes水浴脱蜡及两步重叠pcr法，从福尔马林固定石蜡包埋人体组织中获取长片段dna，即myc基因，并利用sanger测序进行验证。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：

一种利用两步重叠pcr法获取人体组织中myc基因的方法，包括如下步骤：

(1)取福尔马林固定石蜡包埋人体组织样本，按照8μm～12μm的厚度切片，再进行tes水浴脱蜡操作，其中，tes水浴脱蜡操作的过程为：加入800μl～1200μl的tes(三羟甲基甲胺基乙磺酸)溶液，充分震荡后，在50℃～60℃下孵育25min～35min，再次充分震荡并混合均匀，再在4℃下、转速为8000rpm～14000rpm的离心机下离心10min～15min，弃去上清液，并重复tes水浴脱蜡操作2～3次；

(2)提取经过脱蜡后的人体组织样本的dna；

(3)查找并选择7条长度相同的myc基因序列；

(4)根据步骤(3)查找到的myc基因序列，设计16条myc基因的特异性引物，其序列号如下：

第1条：f1-agaagggcagggcttctca、r1-atctaactcgctgtagta；

第2条：f2-aaagaacggagggagggat、r2-tatgggcaaagtttcgtgg；

第3条：f3-cgaaactttgcccatagc、r3-tggacttcggtgcttacctg；

第4条：f4-ggtaagcaccgaagtccac、r4-aaagcaggaatgtccgac；

第5条：f5-cggacattcctgctttattg、r5-aggagaatcggacacatcc；

第6条：f6-tgtccgattctcctgga、r6-gcactcaatacggagatgc；

第7条：f7-tctccgtattgagtgcga、r7-ttagtgaaccagcggcttg；

第8条：f8-agccgctggttcactaa、r8-gtcgcagtagaaatacggc；

第9条：f9-gtatttctactgcgacgagg、r9-ccaaggtttcagaggtgatg；

第10条：f10-aaccttgggctttagcg、r10-ttcatacactccctgccac；

第11条：f11-cacttcttcttacctcccgt、r11-ttcccaagcacctcctat；

第12条：f12-aggtgcttgggaatgtg、r12-cacctgtaatcccagcact；

第13条：f13-ccaaagtgctgggattaca；r13-tgcgtagttgtgctgatg

第14条：f14-cacatcagcacaactacgc、r14-tggacggacaggatgtatgc；

第15条：f15-catacatcctgtccgtcca、r15-agactcagccaaggttgtga；

第16条：f16-ccttggctgagtcttgaga、r16-aataaaataactggca；

(5)重叠pcr扩增：其中，重叠pcr扩增分为两步，具体为：

第一步pcr扩增：利用步骤(4)中的16条myc基因的特异性引物对步骤(2)中提取的dna进行pcr(聚合酶链式反应)扩增实验，从而扩增myc基因的dna片段，获得16条扩增产物；

pcr扩增的条件为：预变性：93℃～95℃、4min～6min；变性：93℃～95℃、30s～45s；退火：50℃～60℃、30s～1min；延伸：72℃、40s～1min；最终延伸：72℃、7min～10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环30～40次；

第二步pcr扩增：将第一步pcr扩增的16条扩增产物每个取2μl并与19μl正向引物、19μl反向引物充分混合，进行pcr扩增反应，从而扩增出全长为5279bp的dna片段；其中，正向引物为步骤(4)中f1-agaagggcagggcttctca，反向引物为步骤(4)中r16-aataaaataactggca；

pcr扩增反应的条件为：预变性：95℃、4min；变性：95℃、15s；退火：56℃、30s；延伸：72℃、6min；最终延伸：72℃、10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环35次；

(6)纯化dna片段：加入磁珠，磁珠的体积为dna片段体积的0.45～0.60倍，在转速为1800rpm～2000rpm的涡旋仪中涡旋10min，再去除其中的液体；加入400μl～600μl、质量浓度为70％的乙醇，混匀并去除内部液体，再次加入400μl～600μl、质量浓度为70％的乙醇，混匀并去除内部液体；加入50μl～100μl的洗脱缓冲液，在转速为2000rpm的涡旋仪中涡旋1min，保持dna片段的浓度在100ng/μl；重复纯化dna片段1次，获得myc目的基因；

(7)测定dna浓度：对myc目的基因进行定量，测定其dna浓度，保持目的基因的dna浓度为100ng/μl，在4℃暂时保存，或者-20℃保存1个月；

(8)基因检测：对myc目的基因进行检测对比和数据分析。

利用本发明两步重叠pcr法获取人体组织中myc基因的方法的有益效果为，采用tes取代二甲苯进行脱蜡操作，脱蜡效果更好，对环境与人体的损伤更小，操作简单、成本低廉；提取的dna片段长度较短，利用两步重叠pcr法，扩增出5279bp不同序列的myc目的基因的dna片段，极大地提高了目的基因的纯度及浓度；应用sanger测序法验证了目的基因的片段，为生物医学方面的进一步科研工作提供便利；本方法可将碎片dna拼接成长片段目的基因，准确度高、效率高，所获得目的基因的dna片段纯度与含量高。

附图说明

图1为两步重叠pcr法扩增16条myc目的基因片段；

图2为两步重叠pcr法扩增5279bpmyc目的基因片段；

图3为sanger测序法测定引物f2和r2扩增出的myc目的基因片段与blast比对的结果；

图4为sanger测序法测定引物f15和r15扩增出的myc目的基因片段与blast比对的结果。

具体实施方式

一种利用两步重叠pcr法获取人体组织中myc基因的方法，包括如下步骤：

(1)取福尔马林固定石蜡包埋人体组织样本，按照8μm～12μm的厚度切片，并装至1.5ml的ep管中，再进行tes水浴脱蜡操作；其中，tes水浴脱蜡操作的过程为：加入800μl～1200μl的tes溶液，充分震荡后，在50℃～60℃下孵育25min～35min，再次充分震荡并混合均匀，再在4℃下、转速为8000rpm～14000rpm的离心机下离心10min～15min，弃去上清液，并重复tes水浴脱蜡操作2～3次；

(2)提取经过脱蜡后的人体组织样本的dna，提取方法参考qiagen试剂盒说明书，具体为genereaddnaffpekit，no.180134；

(3)从pubmed上查找并选择7条长度相同的myc基因序列，具体的序列名称分别为：

1.>ref|nc_000008.11|:127736069-127741434homosapienschromosome8,grch38.p7；

2.>ref|ng_007161.1|:5000-10365homosapiensmycproto-oncogene,bhlhtranscriptionfactor(myc),refseqgeneonchromosome8；

3.>emb|cu310075.1|:55001-60366humandnasequencefromclonexx-ncih2171_7c07,completesequence；

4.>emb|cu310073.1|:65021-70386humandnasequencefromclonexx-ncih2171_15f08,completesequence；

5.>gb|ac103819.3|:87653-93018homosapienschromosome8,clonectd-3056o22,completesequence；

6.>gb|ay214166.1|:1872-7237homosapiensv-mycmyelocytomatosisviraloncogenehomolog(avian)(myc)gene,completecds；

7.>gb|af315312.2|:61930-67295homosapienschromosome8clonerp1-80k22map8q24.3,completesequence；

(4)根据步骤(3)查找到的myc基因序列，设计16条myc基因的特异性引物，其序列号如下：

第1条：f1-agaagggcagggcttctca、r1-atctaactcgctgtagta；

第2条：f2-aaagaacggagggagggat、r2-tatgggcaaagtttcgtgg；

第3条：f3-cgaaactttgcccatagc、r3-tggacttcggtgcttacctg；

第4条：f4-ggtaagcaccgaagtccac、r4-aaagcaggaatgtccgac；

第5条：f5-cggacattcctgctttattg、r5-aggagaatcggacacatcc；

第6条：f6-tgtccgattctcctgga、r6-gcactcaatacggagatgc；

第7条：f7-tctccgtattgagtgcga、r7-ttagtgaaccagcggcttg；

第8条：f8-agccgctggttcactaa、r8-gtcgcagtagaaatacggc；

第9条：f9-gtatttctactgcgacgagg、r9-ccaaggtttcagaggtgatg；

第10条：f10-aaccttgggctttagcg、r10-ttcatacactccctgccac；

第11条：f11-cacttcttcttacctcccgt、r11-ttcccaagcacctcctat；

第12条：f12-aggtgcttgggaatgtg、r12-cacctgtaatcccagcact；

第13条：f13-ccaaagtgctgggattaca；r13-tgcgtagttgtgctgatg

第14条：f14-cacatcagcacaactacgc、r14-tggacggacaggatgtatgc；

第15条：f15-catacatcctgtccgtcca、r15-agactcagccaaggttgtga；

第16条：f16-ccttggctgagtcttgaga、r16-aataaaataactggca；

(5)重叠pcr扩增：其中，重叠pcr扩增分为两步，具体为：

第一步pcr扩增：利用步骤(4)中的16条myc基因的特异性引物对步骤(2)中提取的dna进行pcr扩增实验，从而扩增myc基因的dna片段，获得16条扩增产物，其中，pcr扩增的过程参考kapalongrangehotstartpcrkit(kk3501-07959141001)；

pcr扩增的条件为：预变性：93℃～95℃、4min～6min；变性：93℃～95℃、30s～45s；退火：50℃～60℃、30s～1min；延伸：72℃、40s～1min；最终延伸：72℃、7min～10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环30～40次；

上述16条myc基因的特异性引物进行pcr扩增的具体条件如下表：

第二步pcr扩增：将第一步pcr扩增的16条扩增产物每个取2μl并与19μl正向引物、19μl反向引物充分混合，参考kapalongrangehotstartpcrkit(kk3501-07959141001)，按照体系扩大3倍配制混合液，进行pcr扩增反应，从而扩增出全长为5279bp的dna片段；其中，正向引物为：f1-agaagggcagggcttctca，反向引物为：r16-aataaaataactggca；扩增反应的条件为：预变性：95℃、4min；变性：95℃、15s；退火：56℃、30s；延伸：72℃、6min；最终延伸：72℃、10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环35次；

(6)纯化dna片段：加入ampurepb磁珠，ampurepb磁珠的体积为dna片段体积的0.45～0.60倍，在转速为1800rpm～2000rpm的涡旋仪中涡旋10min，再去除其中的液体；加入400μl～600μl、质量浓度为70％的乙醇，轻弹30s～60s混匀并去除内部液体，再次加入400μl～600μl、质量浓度为70％的乙醇，并轻弹30s～60s混匀、去除内部液体；加入50μl～100μl的洗脱缓冲液，在转速为2000rpm的涡旋仪中涡旋1min，保持dna片段的浓度在100ng/μl；重复该纯化dna片段1次，获得myc目的基因；

(7)测定dna浓度：使用nanodrop或qubit进行定量，测定myc目的基因的dna浓度，保持目的基因的dna浓度为100ng/μl，在4℃保存2天，或者-20℃保存1个月；

(8)基因检测：应用sanger测序法对myc目的基因进行检测及验证，并将得到的序列与数据库中的序列进行对比和数据分析。

如图1所示，利用两步重叠pcr法扩增出87bp、263bp、216bp、309bp、408bp、230bp、513bp、317bp、844bp、202bp、489bp、456bp、357bp、309bp、226bp及356bp长度的myc基因片段。

如图2所示，利用两步重叠pcr法扩增出5279bp长度的myc基因片段。

如图3所示，选定引物f2和r2扩增出的myc目的基因片段，发现所测序列与数据库中myc两条序列的同源性相似度为100％，覆盖率为100％，说明本申请所测定的序列与myc目的基因吻合。

如图4所示，选定引物f15和r15扩增出的myc目的基因片段，发现所测序列与数据库中myc两条序列的同源性相似度为100％，覆盖率为100％，说明本申请所测定的序列与myc目的基因吻合。

通过sanger测序法分别测定16条特异性引物扩增出的myc目的基因片段，并与blast数据库中myc的两条序列进行比对，发现所测序列与数据库中myc两条序列的同源性相似度为100％，覆盖率为100％，说明本申请所测定的序列与myc目的基因吻合。

综上所述，通过福尔马林固定石蜡包埋结合两步重叠pcr扩增获取人体组织中myc基因的方法，准确度高、效率高，样本纯度与含量高，可将碎片dna拼接成长片段目的基因。