一种通过环氧交联包埋磁性纳米粒子固定酶的方法与流程

本发明涉及酶的固定化
技术领域：
，具体涉及一种通过环氧交联包埋磁性纳米粒子固定酶的方法。
背景技术：
：以高分子为壳无机磁性材料为核的杂化微球，是近二十年来人们研究的热点之一。这种方法通过在磁性粒子的表面改性，聚合反应发生在磁性粒子表面并接枝一种反应性功能活性基团(如：-oh、-cooh、-cho、-nh2等)，使得微球表面具有很好的生物相容性，既可直接结合生物酶、细胞、抗体、药物、金属离子及有机物等，也可经过化学修饰后再结合，以满足不同的需要；内部有磁性物质存在，在外磁场作用下可有效地富集、分离、回收和再利用。但是高分子杂化材料外壳会增加磁性颗粒的体积，同时对于作为固相载体磁性颗粒的磁力性质会产生干扰。此外，较大体积的具有外壳包被的磁性颗粒及其聚合物会产生非特异性的污染物吸附现象。然而在小体积且未被外壳包裹的颗粒中，这种非特异性结合现象很少见。m.koneracka,p.kopcanský,m.timko,c.n.ramchand,a.desequeira,m.trevan,directbindingprocedureofproteinsandenzymestofinemagneticparticles,j.mol.catal.benzym18(2002)13-18.酶的固定化方法可分为物理法和化学法两大类。吸附法通常存在吸附作用力较弱而发生酶从载体脱落等缺点。包埋法只有小分子可通过聚合物网络得到包埋，不适用与大分子底物。共价法由于操作过程复杂、反应条件通常比较强烈会导致固定化酶活性较低。交联法是利用双功能或多功能交联试剂，使得酶分子与交联剂之间形成共价键，实现对酶分子的固定化，缺点是交联剂能够与酶分子的活性中心结合，会一定程度上造成酶失活或者专一性改变。如何充分利用未表面改性的磁性纳米颗粒的优良性质对酶进行不损伤酶活的简单有效的固定化，尚未见报导。技术实现要素：本发明提供一种通过环氧交联包埋磁性纳米粒子固定酶的方法，目的是实现了充分利用未表面改性的磁性纳米颗粒的优良性质对酶进行不损伤酶活的简单有效的固定化。本发明通过以下技术方案实现：一种通过环氧交联包埋磁性纳米粒子固定酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：1）在温度为0～4℃条件下，将酶加入ph6～9的磷酸盐缓冲液中，并以10～60rpm/min的速度搅拌直至全部溶解；2）在温度为0～4℃条件下，将具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子加入到步骤1）制得的混合溶液中，并以10～60rpm/min速度搅拌直至混合均匀；3）在温度为0～4℃条件下，将环氧氯丙烷逐滴加入到步骤2）制得的混合溶液中，并在10～60rpm/min速度搅拌的条件下交联反应24～48h，制得酶/磁性纳米颗粒复合微球；4）将步骤3）制备的酶/磁性纳米颗粒复合微球通过磁性物质分离，并用去离子水洗涤2～4次，然后分散在0～4℃、ph6～9的磷酸盐缓冲液中保存。本发明进一步解决的技术改进方案是：所述步骤1）、4）中的磷酸盐缓冲液为浓度0.005～0.1m的磷酸钠缓冲液、或为磷酸钾缓冲液。本发明进一步解决的技术改进方案是：所述步骤2）中的铁氧体纳米粒子由共沉淀法制备，为粒径介于10～20nm的fe2o4、mnfe2o4、cufe2o4、nife2o4、znfe2o4、mgfe2o4纳米粒子、或为上述纳米粒子的混合物。本发明进一步解决的技术改进方案是：所述步骤2）制得的混合溶液中铁氧体纳米粒子与酶的浓度比为1mg/ml：(0.01～1)mg/ml。本发明进一步解决的技术改进方案是：所述步骤3）中的环氧氯丙烷在溶液中的浓度为0.5～1.5m。本发明进一步解决的技术改进方案是：所述步骤3）制得的酶/磁性纳米颗粒复合微球中酶固定化率大于90%。本发明进一步解决的技术改进方案是：所述步骤1）中的酶为果胶酶、或为淀粉酶、或为胃蛋白酶。本发明与现有技术相比，具有以下明显优点：一、本发明在未被高分子为壳包裹时，磁性纳米颗粒的尺寸不会增加，因此其结合能力和磁力性质不会受到影响，在外界磁场条件下，可以实现快速分离。二、本发明与含有包裹层的纳米颗粒相比，未修饰的磁性纳米颗粒在尺寸不增加的情况下，不会发生过多的非特异性结合。三、本发明与具壳粒子相比，在没有外层高分子物质干扰的情况下，磁力响应更加快速灵敏；无壳小粒子具有更大的表面积而具备更高的结合能力。四、本发明酶与粒子结合不会导致结构改变而损失活力，因为通过调节反应时环氧氯丙烷的浓度而调节交联程度，从而不会发生过度的交联而抑制酶的活力。五、如图2所示，本发明环氧氯丙烷可以共价结合酶上的-nh2，-sh和-oh基团，这种类型的交联易于将纳米粒子包埋在交联的酶结构之中，反过来促进了酶在纳米粒子载体上的固定；此交联便于形成以磁性纳米颗粒为载体的酶交联结构；此外在共沉淀法制备纳米颗粒时，在粒子表面形成的-oh同样可以促进环氧氯丙烷引发的交联反应，因此，本发明中的固定化效果更加优良。六、本发明环境友好，经济、制备工艺简单。附图说明图1为固定化酶和游离酶在4℃贮藏条件下的活力变化情况；图2为酶和环氧氯丙烷之间的交联反应示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明技术解决方案作进一步描述：实施例一、制备步骤如下：1）在温度为0℃条件下，将5mg果胶酶加入20rpm/min机械搅拌的ph8的0.01m磷酸钠缓冲液中，直至全部溶解；2）在温度为0℃条件下，将由共沉淀法制备的具有超顺磁性的粒径10～20nm的10mgmnfe2o4纳米粒子加入20rpm/min机械搅拌的步骤1）制得的混合溶液中，直至混合均匀；3）在温度为0℃条件下，20rpm/min机械搅拌的条件下将环氧氯丙烷逐滴加入到步骤2）制得的混合溶液中，至浓度为0.6m，并在此条件下交联反应30h，获得果胶酶固定化率为90%以上的果胶酶/磁性纳米颗粒复合微球；4）将步骤3）制备的果胶酶/磁性纳米颗粒复合微球通过磁性物质分离，并用去离子水洗涤3次，然后分散在0℃、ph8的0.01m磷酸钠缓冲液中保存。实施例二、制备步骤如下：1）在温度为4℃条件下，将4mg淀粉酶加入30rpm/min机械搅拌的ph5、0.5m的磷酸钾缓冲液中，直至全部溶解；2）在温度为4℃条件下，将由共沉淀法制备的具有超顺磁性的粒径10～20nm的20mgcufe2o4纳米粒子加入30rpm/min机械搅拌的步骤1）制得的混合溶液中，直至混合均匀；3）在温度为4℃条件下，30rpm/min机械搅拌的条件下，将环氧氯丙烷逐滴加入到步骤2）制得的混合溶液中，至浓度为0.5m，并在此条件下交联反应24h，获得淀粉酶固定化率为90%以上的淀粉酶/磁性纳米颗粒复合微球；4）将步骤3）制备的淀粉酶/磁性纳米颗粒复合微球通过磁性物质分离，并用去离子水洗涤3次，然后分散在4℃、ph5的0.05m磷酸钾缓冲液中保存。实施例三、制备步骤如下：1）在温度为4℃条件下，将5mg胃蛋白酶加入20rpm/min机械搅拌的ph4的0.01m的磷酸钾缓冲液中，直至全部溶解。2）在温度为4℃条件下，将由共沉淀法制备的具有超顺磁性的粒径10～20nm的30mgfe2o4纳米粒子加入40rpm/min机械搅拌的步骤1）制得的混合溶液中，直至混合均匀。3）在温度为4℃条件下，40rpm/min机械搅拌的条件下将环氧氯丙烷逐滴加入到步骤2）制得的混合溶液中至浓度为1.0m，并在此条件下交联反应36h，获得胃蛋白酶固定化率为90%以上的胃蛋白酶/磁性纳米颗粒复合微球。4）将步骤3）制备的胃蛋白酶/磁性纳米颗粒复合微球通过磁性物质分离，并用去离子水洗涤3次，然后分散在4℃、ph4的0.01m磷酸钾缓冲液中保存。如图1所示，通过固定化和游离态果胶酶、淀粉酶和胃蛋白酶在4℃贮藏时酶活力单位（u）的变化分析，发现三种实施例中的酶活力经过30天的低温贮藏之后，均显著高于游离态的酶。通过固定化和游离态果胶酶、淀粉酶和胃蛋白酶在固定化前后酶活力单位（u）的变化分析，发现三种实施例中的酶活力单位经过固定化之后，与游离态的酶活力单位无显著性差异。如下表所示：类别固定前酶活（u）固定后酶活（u）果胶酶2.07±0.03a2.05±0.05a淀粉酶26.03±0.15a26.11±0.11a胃蛋白酶12.11±0.09a12.05±0.13a每一行数据的相同小写字母代表无显著性差异（p<0.05）需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述技术方案的基础上所做出的等同替换或替代，均属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。当前第1页12