鼠源GPR35高通量筛选模型的构建方法及应用与流程

本发明涉及gpcr高通量筛选模型的构建方法及应用，具体地说是鼠源gpr35高通量筛选模型的构建方法及应用。本发明基于无标记细胞整合药理学技术，利用鼠源gpr35稳定转染的细胞系，建立鼠源gpr35激动剂和拮抗剂高通量筛选的方法，对快速发现鼠源gpr35的高活性配体及gpr35相关潜在药物具有重要作用。

背景技术：

g蛋白偶联受体(g-protein-coupledreceptor,gpcr)是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，大约40％的现代药物直接靶向该受体家族。gpr35是在1998年发现的一种a类视紫红质样的孤儿gpcr，它含有309个氨基酸，在人与鼠之间仅有70％的同源性，高表达于小肠、结肠及胰腺组织，在心脏、免疫细胞、背部神经节及脊髓中也有相当的表达。虽然gpr35在1998年已被鉴定，但其生物学功能研究进展十分缓慢，直到近几年多种激动剂被报道后才有所改观，研究表明gpr35与心力衰竭、神经元兴奋剂和突触释放的调节、疼痛及炎症等疾病的发生发展密切相关。因此，构建gpr35的高通量筛选模型对其激动剂的发现具有重要作用，也为gpr35的生物学功能及药理学特征的深入研究奠定基础。

近年来，很多研究者在人gpr35模型上开展激动剂的发现研究，发现的gpr35内源性激动剂只有犬尿酸和2-酰基溶血磷脂酸，后续发现敏喘宁、呋喃苯胺酸、布美他尼、色苷酸、帕莫酸和噻唑烷二酮类衍生物也对人gpr35具有很好的激动活性。然而由于人源gpr35和鼠源gpr35的同源性差异，这些对人gpr35具有很好激动活性的分子，对鼠gpr35的激动活性很弱，如犬尿酸对鼠gpr35比人gpr35的激动活性低30倍，后续发现的激动剂对鼠gpr35比人gpr35的激动活性低十倍甚至上千倍，限制了这些探针分子在动物体内研究gpr355生物学意义及药理学功能的深入研究。因此，构建鼠gpr35高通量筛选模型发现对鼠gpr35具有较好激动活性的分子对阐述gpr35的生物学意义与功能具有重要意义。

目前关于本发明中提到的基于无标记细胞整合药理学技术利用鼠源gpr35稳定转染的细胞系建立鼠源gpr35的高通量筛选模型尚未报道。

技术实现要素：

本发明涉及抗涉及鼠源gpr35高通量筛选模型的构建方法及应用，

鼠源gpr35高通量筛选模型，基于鼠源gpr35稳转细胞系，利用无标记细胞整合药理学技术，借助于探针分子，建立鼠源gpr35筛选模型的特征信号谱图。

在最优转染条件下，在cho-k1细胞上转染鼠源gpr35质粒，通过抗生素筛选、单克隆挑选、扩增培养及功能测定获得稳定表达鼠源gpr35受体的细胞系,利用无标记细胞整合药理学技术，借助于探针分子，建立鼠源gpr35筛选模型的特征信号谱图。

所述的最优转染条件包括cho-k1细胞在直径10cm培养皿的接种密度为1.5×10⁶个，细胞培养液的体积为10ml，鼠源gpr35质粒和lipo2000转染试剂的比例为1：2-5(优选比例为1：3)，使用鼠源gpr35质粒的量为4～10μg，g418抗生素浓度为400μg/ml。

所述的利用无标记细胞整合药理学技术是基于无标记的共振波导光栅(rwg)生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的响应信号，称为动态质量重置(dmr)响应信号，此信号为波长变化的响应值(pm)，代表了靶点及其激活通路在细胞水平的整体响应；基于此技术构建鼠源gpr35高通量筛选模型的方法条件包括以下方面：稳转鼠源gpr35的cho-k1细胞在384孔板中接种密度为1.5×10⁴个/孔，细胞培养液的体积为40μl/孔，接种后细胞培养时间为12h。

探针分子为对鼠源gpr35受体有激动作用的犬尿酸和敏喘宁，其中犬尿酸的浓度范围为0.391μm～100.000μm，敏喘宁的浓度范围为0.002μm～1.250μm。

犬尿酸和敏喘宁分别作用于稳定表达鼠源gpr35受体的cho-k1细胞后产生的实时dmr信号特征谱，检测时间范围为10min～60min。

一种按照权利要求所述的鼠源gpr35高通量筛选模型的应用于鼠源gpr35高通量筛选模型用于筛选鼠源gpr35的激动剂和拮抗剂。

本发明的优势目的之一是基于无标记细胞整合药理学技术利用稳转鼠源gpr35的cho-k1细胞构建高通量筛选模型；目的之二是鼠源gpr35高通量筛选模型的建立可利于鼠源gpr35高活性配体的发现，为孤儿受体生物学意义与功能的研究提供候选配体。

附图说明

图1在质粒和转染试剂不同比例条件下犬尿酸在cho-k1转染鼠源gpr35受体细胞上的dmr信号，(a)未加质粒和转染试剂，(b)质粒和转染试剂的比例为4μg:12μl，(c)质粒和转染试剂的比例为6μg:18μl，(d)质粒和转染试剂的比例为8μg:24μl，(e)质粒和转染试剂的比例为10μg:30μl；其中犬尿酸的浓度单位为μm。

图2犬尿酸在单克隆挑选出不同细胞团上的dmr信号，(a)no.4,(b)no.6,(c)no.8和(d)no.12；其中犬尿酸的浓度单位为μm。

图3犬尿酸和敏喘宁在稳定表达鼠源gpr35受体的cho-k1细胞上的激动dmr特征信号谱，(a)犬尿酸的激动dmr特征信号谱，(b)敏喘宁的激动dmr特征信号谱，(c)犬尿酸和敏喘宁的浓度-响应依赖曲线，犬尿酸和敏喘宁的浓度单位为μm。

图4犬尿酸和敏喘宁在稳定表达鼠源gpr35受体的cho-k1细胞上的脱敏dmr特征信号谱，(a)犬尿酸对敏喘宁脱敏的dmr特征信号谱，(b)敏喘宁对敏喘宁脱敏的dmr特征信号谱，(c)犬尿酸和敏喘宁对敏喘宁脱敏的浓度-响应依赖曲线，犬尿酸和敏喘宁的浓度单位为μm。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：优化cho-k1细胞上的鼠源gpr35的质粒量

中国仓鼠卵巢细胞亚株cho-k1购于中国科学院上海细胞库，鼠源gpr35质粒购于武汉淼灵生物科技有限公司，转染试剂lipo2000购于gibco，抗生素g418购于sigma，倒置显微镜购于olympus，特征信号检测仪epic购于corning。

首先，在10cm的细胞培养皿中接种cho-k1细胞，细胞密度为1.5×10⁶个，加入的f12k培养基(含10％的胎牛血清)体积为10ml，共准备5盘细胞，放入co2培养箱中培养24h。然后按鼠源gpr35质粒和lipo2000转染试剂的比例为1：3，依次加入鼠源gpr35的质粒为0μg、4μg、6μg、8μg和10μg，轻轻混匀，放入培养箱培养24h。最后，对转染不同浓度鼠源gpr35的细胞进行dmr信号的检测，其中每个比例对应的谱图见图1，从图中可以看出，当质粒量为6μg时，dmr信号强度最大，说明最佳的鼠源gpr35质粒转染浓度为6μg。

实施例2：稳定转染鼠源gpr35的cho-k1细胞模型的构建

首先，在10cm的细胞培养皿中接种cho-k1细胞，细胞密度为1.5×10⁶个，加入的培养基体积为10ml，放入co2培养箱中培养24h。然后，加入最佳鼠源gpr35的质粒6μg和lipo2000转染试剂18μl，轻轻混匀，放入培养箱培养24h之后备用。最后，在培养皿中加入含抗生素g418浓度为400μg/ml的培养基，每2-3天更换，直到可以观察到2-3mm的细胞团，再进行单克隆挑选、扩增培养及功能测定，获得稳定表达鼠源gpr35受体的cho-k1细胞。选择的稳转细胞通常是dmr信号响应高且呈剂量依赖特征的细胞。经以上操作，本发明选择的较好的稳转细胞标号为no.4、no.6、no.8和no.12，它们对应的dmr响应信号谱图见图2。从图中可以看出，这四个标号的细胞都能呈现剂量依赖的dmr响应，其中no.12的响应信号最强，因此后续实验将在no.12扩增的稳转鼠源gpr35受体的细胞进行高通量筛选模型的构建。

实施例3：稳转鼠源gpr35受体的cho-k1细胞(cho-k1-gpr35)的激动dmr特征信号谱

首先将处于对数生长期cho-k1-gpr35细胞以15,000个/孔的密度接种在生物兼容的384孔板中，每孔的接种体积为40μl，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养12h，至细胞生长融合度达95％左右，进行活性测定实验。将培养好的细胞，吸去培养基，加入检测hank's平衡盐溶液(含10mm的hepes)，每孔加入体积为30μl，平衡1h；等基线平稳后，建立2min的基线，分别加入犬尿酸和敏喘宁，检测1h。其中犬尿酸的浓度为100.000μm、50.000μm、25.000μm、12.500μm、6.250μm、3.125μm、0.781μm和0.391μm，加入体积为10μl，每个浓度点重复2次；敏喘宁的浓度为1.250μm、0.625μm、0.313μm、0.156μm、0.078μm、0.039μm、0.020μm、0.010μm、0.005μm和0.002μm，加入体积为10μl，每个浓度点重复2次。实验获得的犬尿酸和敏喘宁的激动dmr特征信号谱及对应的ic50值见图3。从图中可以看出，犬尿酸和敏喘宁在cho-k1-gpr35细胞上能产生剂量依赖的实时dmr响应曲线，其剂量响应曲线呈单相“s”型且都达到饱和响应，对应的ec50值分别为15.14±2.51μm和0.014±0.002μm，敏喘宁对鼠源gpr35的激动活性强于犬尿酸。可见，在受体激动分析中，能成功构建鼠源gpr35的激动dmr特征信号谱。

实施例4：稳转鼠源gpr35受体的cho-k1细胞(cho-k1-gpr35)的脱敏dmr特征信号谱

首先将处于对数生长期cho-k1-gpr35细胞以15,000个/孔的密度接种在生物兼容的384孔板中，每孔的接种体积为40μl，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养12h，至细胞生长融合度达95％左右，进行活性测定实验。将培养好的细胞，吸去培养基，加入检测指定的hank's平衡盐溶液(含10mm的hepes)，每孔加入体积为30μl，平衡1h；分别加入犬尿酸和敏喘宁，其中犬尿酸的浓度为100.000μm、50.000μm、25.000μm、12.500μm、6.250μm、3.125μm、0.781μm和0.391μm，加入体积为10μl，每个浓度点重复2次；敏喘宁的浓度为1.250μm、0.625μm、0.313μm、0.156μm、0.078μm、0.039μm、0.020μm、0.010μm、0.005μm和0.002μm，加入体积为10μl，每个浓度点重复2次。预处理1h，重新建立2min的基线，加入浓度为500nm的敏喘宁，检测1h。实验获得的犬尿酸和敏喘宁脱敏的dmr特征信号谱及对应的ic50值见图4。从图中可以看出，经不同浓度的犬尿酸和敏喘宁预处理后，敏喘宁在cho-k1-gpr35细胞上能产生剂量依赖的实时dmr响应曲线，其剂量响应曲线呈单相“s”型且都达到饱和响应，对应的ic50值分别为13.20±1.12μm和0.019±0.001μm。可见，在受体脱敏分析中，能成功构建鼠源gpr35的脱敏dmr特征信号谱。