水稻Os10g0562700基因及其突变体基因ssr1与应用的制作方法

文档序号：14649903发布日期：2018-06-08 21:34阅读：484来源：国知局

本发明涉及基因工程和分子育种领域，具体地说，涉及水稻Os10g0562700基因及其突变体基因ssr1与应用。

背景技术：

水稻(Oryza sativa L.)是我国重要的粮食作物之一，全世界超过二分之一的人口以稻米为主食。茎秆的形态结构与株型、抗倒伏性及营养物质的运输紧密相关，因此，研究水稻茎秆发育调控机理对于指导水稻育种具有重要意义。

水稻茎秆由茎节和节间组成。在水稻茎秆发育过程中，随着节间的伸长，髓的中央部分在生长过程中逐渐消失，进而形成髓腔，除了髓腔的部分，其他节间组织被称为节间壁。目前为止，水稻茎秆不同截面形状主要分为三种类型，即完全实心的茎秆、厚节间壁空心秆和薄节间壁空心秆 (Ookawa et al.,2010,New approach for rice improvement using a pleiotropic QTL gene for lodging resistance and yield.Nat.Commun.1,132.)。髓腔作为水稻茎秆一个特殊的形态结构，其形成过程中伴随着细胞的程序性死亡。茎初始伸长期，所有位于茎壁的薄壁细胞退化产生一个空心管，连接到根通气组织并为地下部分提供氧气。厚而粗壮的茎秆与水稻杆壁厚度和髓腔大小紧密相关，挖掘影响水稻茎秆髓腔发育的基因，培育厚而坚实的茎秆对水稻理想株型的选育和抗倒伏育种具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一个新的调控植物茎秆髓腔发育的基因Os10g0562700。

本发明的另一目的是提供水稻Os10g0562700基因的突变体ssr1基因。

本发明的再一目的是提供水稻Os10g0562700基因及其突变体ssr1基因的应用。

本发明的又一目的是提供与水稻实心茎秆性状相关的DNA分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的调控植物茎秆髓腔发育的基因为Os10g0562700(SEQ ID NO:3)，其中基因Os10g0562700编码的蛋白为：

1)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

2)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1) 衍生的蛋白。

本发明还提供水稻Os10g0562700基因在调控植物茎秆壁厚和硬度及株高中的应用，其中所述调控是指使植物茎秆壁的厚度和硬度下降，且使株高增加。其中，所述植物包括但不限于水稻。

本发明还提供水稻Os10g0562700基因的突变体ssr1基因，该突变基因是从籼稻品种6104经⁶⁰Co-γ辐射诱变产生的可稳定遗传的变异株中，采用图位克隆技术克隆获得的。该水稻变异株的主要特征为：倒1节间(穗茎节)为完全实心结构，倒2～5节间实心特性逐渐减弱，命名为水稻变异株ssr1(solid stalk rice 1)。

本发明的突变基因ssr1核酸序列为：

i)水稻Os10g0562700基因起始密码子后第3216-3219位碱基由AAAA突变成AAA所形成的突变基因(该突变位于Os10g0562700基因第4外显子上)；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

iii)i)或ii)所示序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，且在与基因Os10g0562700的等同位置上包含由AAAA至AAA突变；或

iv)在严格条件下与i)或ii)所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，且在与基因 Os10g0562700的等同位置上包含由AAAA至AAA突变；所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE 或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

v)与i)或ii)的核苷酸序列具有85％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，且在与基因Os10g0562700的等同位置上包含由AAAA至AAA突变。

本发明还提供由突变基因ssr1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供突变基因ssr1在提高植物茎秆壁厚和硬度以及降低株高提高抗倒伏性中的应用。所述应用包括：

1)使植物包含ssr1基因；或

2)使植物表达ssr1基因编码的蛋白；

其中，所述植物包括但不限于水稻。

本发明还提供突变基因ssr1在水稻育种中的应用。

本发明还提供突变基因ssr1在水稻抗倒伏育种中的应用。

本发明还提供与水稻实心茎秆性状相关的DNA分子标记，所述DNA分子标记位于水稻 Os10g0562700基因起始密码子后第3216-3219位碱基，序列为AAA-、AA-A、A-AA或-AAA，其中- 表示碱基缺失，四个碱基AAAA中缺失任一个碱基A的水稻品系表现出茎秆厚而粗壮的性状。

本发明还提供用于扩增所述DNA分子标记的引物ASP，包括：

正向引物AS1-F 5′-AGCAGGCAGAGGAGATGAGAT-3′；

反向引物AS2-R 5′-TATGTCTCTGTCCGCTTTTTTATGTT-3′；

反向引物AS7-R 5′-CGTCAAGGGCTTCAACAACT-3′；

正向引物AS8-F 5′-TATCCCACAAGAGGCTTACACC-3′。

等位基因特异性PCR引物AS1-F和AS2-R分别引入了针对野生型和突变体ssr1特异序列的碱基错配，使得引物对AS1-F和AS7-R在整个反应体系中只能够识别ssr1特异性序列模板，扩增出365bp 大小片段；引物对AS8-F和AS2-R在整个PCR反应体系中只能识别野生型特异性序列模板，扩增出 192bp大小片段；引物对AS8-F和AS7-R可识别野生型和突变体ssr1序列，扩增出野生型大小片段为 515bp，扩增出突变体ssr1大小片段为514bp。综上，AS1-F、AS8-F与AS7-R用于扩增突变体，AS8-F 与AS2-R、AS7-R用于扩增野生型。

本发明还提供所述DNA分子标记、所述引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在水稻分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供所述DNA分子标记、所述引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在水稻 Os10g0562700基因分型中的应用。

本发明还提供所述DNA分子标记、所述引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定或选育含有突变基因ssr1的水稻品种中的应用中的应用。

本发明还提供所述DNA分子标记、所述引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定或选育水稻抗倒伏品种中的应用。

本发明还提供所述DNA分子标记、所述引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定或选育实心茎秆水稻种质资源中的应用。

前述应用包括：提取待测水稻的基因组DNA，利用引物ASP进行PCR扩增反应，电泳检测扩增产物，如果仅扩增出514bp和365bp两个特征条带，则待测水稻存在突变基因ssr1，为实心茎秆水稻品种，如果仅扩增出515bp和192bp两个特征条带，则待测水稻不存在突变基因ssr1，非实心茎秆水稻品种。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次发现了水稻基因Os10g0562700具有调控植物茎秆髓腔发育的生物学功能，进一步从籼稻品种6104经⁶⁰Co-γ辐射诱变产生的可稳定遗传的变异株中，采用图位克隆技术克隆获得基因 Os10g0562700的突变体基因ssr1，ssr1突变体伴随着株高降低、茎秆硬度增强等性状，对水稻抗倒伏品种的选育具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中野生型与实心杆突变体整体植株照片，其中，左为野生型，右为突变体。

图2为本发明实施例2中野生型与突变体各节间长度照片，其中，Panicle and IN1为穗和倒一节间长度对比、IN2为倒二节间、IN3为倒三节间、IN4为倒四节间、IN5为倒五节间(左为野生型，右为突变体)。

图3为本发明实施例2中野生型与突变体倒一节间组织切片照片，其中，A为野生型倒一节间横切图，B为突变体倒一节间横切图，C为野生型倒一节间纵切图，D为突变体倒一节间纵切图。

图4为本发明实施例4中的基因连锁分析图，其中，A为两套混合池及其亲本在RM590标记处的带型图，B为6122-617/ssr1突变体的F₂中突变型单株及其亲本在RM590标记处的带型图；C为 6723-189/ssr1突变体的F₂代中突变型单株及其亲本在RM590标记处的带型图。

图5为本发明实施例4中基因精细定位分析图。

图6为本发明野生型与ssr1突变体的Os10g0562700基因序列对比图，标亮部分为突变体缺失的碱基。

图7为本发明实施例5中Os10g0562700基因突变位点的结构示意图。

图8为本发明实施例5中野生型与ssr1的SSR1蛋白质的氨基酸序列对比图。

图9为本发明实施例6中野生型、ssr1突变体及其他遗传材料在Os10g0562700基因扩增片段的电泳结果，其中，M为DNA Marker，1为ssr1，2为6104，3为华占，4为9311，5为湘晚籼12，6为 NG6954。

图10为本发明实施例7中6122-617/ssr1组合F₂群体中突变型单株Os10g0562700基因扩增片段的电泳结果。

图11为本发明实施例7中6122-617/ssr1组合F₂群体中野生型单株Os10g0562700基因扩增片段的电泳结果。

图12为本发明实施例8中WT和ssr1蛋白结构域对比图。

图13为本发明实施例8中WT编码的蛋白二级结构预测图。

图14为本发明实施例8中ssr1编码的蛋白二级结构预测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1水稻实心茎秆突变体的筛选

籼稻品种6104进行辐射处理后种植于湖南省长沙宁乡市隆平高科水稻实验基地。对M₂群体各时期、各性状进行田间考察发现在成熟期一个异常植株，其植株变矮、分蘖数减少，如图1所示。进一步对其茎秆性状考察发现，倒1节间为完全实心结构，倒2-5节间实心特性逐渐减弱。该突变体连续自交多代性状均可稳定遗传。

实施例2突变体茎秆特性对比分析

2016年夏，于湖南省长沙市宁乡市隆平高科水稻实验基地种植野生型6104和ssr1突变体各100 株，正常田间管理至完全成熟。随机选取成熟期6104和ssr1各10株用于茎秆性状的考察。与野生型相比，突变体各节间长度显著变短(图2)、各节间茎秆直径减小；抽穗期倒一节间石蜡切片观察分析，ssr1髓腔被大量的薄壁细胞填充，大维管束变小而数目并未改变，细胞层数增加，但大小一致 (图3)。

实施例3基因连锁分析

采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体实验方法如下：剪取新鲜水稻叶片约0.1g加入2.0ml离心管中，放入钢珠后在研磨机上研磨粉碎；往离心管中加入750μL 1.5×CTAB溶液(含1％巯基乙醇)，在65℃条件下水浴40min，每隔5min震荡1次；加入750μL三氯甲烷，将离心管至于摇床摇晃5min 后，12000rpm离心10min后小心吸取上清液500μL置于另一只干净1.5ml离心管中；加入500μL异丙醇混匀，静置20min后12000rpm离心10min；倒掉离心管中的上清液并加入500μL 70％乙醇，混匀静置20min后12000rpm离心10min，倒掉上清液加入500μL 70％乙醇，静置10min后12000rpm离心 10min；弃上清，将离心管置于真空泵抽干机上，60℃条件下真空抽干20min；往离心管中加入200μL 灭菌的ddH₂O溶解DNA，用Nanodrop2000测定其浓度并用灭菌的ddH₂O将DNA稀释至50ng/μL，经 1％琼脂糖凝胶电泳检测质量合格后，用于PCR反应扩增。

BSA(Bulked Segregant Analysis)又称混合群体分离分析法，是利用极端性状进行功能基因挖掘的一种方法。以F₂群体为基础，运用BSA法，构建两套混合池，随机各取15株6122-617/ssr1的F₂群体中实心杆表型和非实心杆表型单株的DNA 10μL混合后构建突变池和非突变池；随机各取15 株6723-189/ssr1的F₂代群体中实心杆表型和非实心杆表型单株的DNA 10μL混合构建突变池和非突变池。然后用中华人民共和国农业部颁布的《水稻品种鉴定技术规程-SSR标记法(NY.T 1433-2014)》公布的48对SSR标记，对两套混合池及其亲本扩增进行多态性筛选。

PCR反应体系：2.0μL模板DNA(50ng/μL)，1.0μL 10×Buffer(MgCl₂)，0.8μL dNTP(2.5mM)， 0.1μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，0.15μL PCR正向引物(0.2μM)，0.15μL PCR反向引物(0.2μM)，5.8μL ddH₂O(灭菌)。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35 个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应，16℃保存。

扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如下：(1)聚丙烯酰胺凝胶的配制：将清洗干净的制胶板及胶条装好固定并调平，按比例向干净的烧杯中加入72ml 的TBE(H₂O:TBE＝13.2:5)、28ml的30％的丙烯酰胺溶液(Acrylamide:Bisacrylamide＝29:1)、720μL 10％的过硫酸铵、64μL的TEMED后充分摇匀。最后用注射器缓慢将胶注入制胶板后，立即将准备好的干净梳子插入封口中并避免气泡产生，约1h后待胶凝固后即可使用。(2)预电泳：待胶凝固后，取下梳子，清理掉上边的凝胶，先在电泳槽的下槽加入适量0.5×TBE的电极缓冲液，将聚合的凝胶板装在电泳槽内并固定，在上槽中注入适量的0.5×TBE的电极缓冲液。接好电源，电压调为260V，电流调为400mA，预电泳10min。(3)电泳：向扩增产物中加入4μL 5×Loading Buffer，混合后吸取 1μL加入上样孔，在电压为260V、电流为400mA条件下进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部时结束。 (4)银染显色：小心拆除制胶板，用去离子水漂洗胶5～10s；将胶置于盛有染液(在500ml水中加入0.7g AgNO₃、50ml无水酒精、5ml醋酸混匀)的盆中，将盆置于摇床上60r/min摇动8min；再将胶用蒸馏水漂洗5s后放入显色液(500ml水中加入10gNaOH和2.5ml甲醛溶液混匀)，轻轻摇动直至条带出现。(5)包胶：将显色后的胶放入清水中漂洗，再用保鲜膜包好，贴好标签，室温下自然干燥后，拍照保存图像。

用48对引物对两套混合池及其亲本扩增进行多态性筛选，结果48对引物中有23对引物存在多态性，进一步对23对引物进行群体分析，发现在RM590这个标记上连锁(图4)，初步将基因定位在第10号染色体标记RM590周围。

实施例4基因的精细定位

用覆盖第10号染色体的63对SSR引物亲本间(6122-617/ssr1、6723-189/ssr1)的多态性进行筛选，再用所筛选的多态标记进行群体验证，进一步确定基因的在染色体上的位置。结果表明 RM25450、RM25840、RM25873、RM25887、RM25893、RM590在亲本间有多态性，再利用 6122-617/ssr1、6723-189/ssr1的F₂分离群体中107株突变型单株验证SSR标记，发现均有交换单株，并按照交换单株数目和标记在染色体上的位置将ssr1基因确定在RM25840与RM25873之间约554kb 的区间内。

为进一步对突变体基因进行精细定位，我们扩大了F₂群体的数量，并且继续在F₂代植株中选取实心表型单株作为定位群体。根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、RGP (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)和Gramene(http://www.gramene.org/)数据库公布的 9311序列和日本晴序列第10染色体上的序列用premer 5.0软件开发出若干个位于RM25840和 RM25873之间的Indel标记，最终将基因定位于Indel10与Indel27之间，物理距离为191.1kb(图5)。用于基因精细定位的引物对序列见表1。

表1用于基因精细定位的引物对序列

实施例5基因克隆与序列分析

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库公布的9311序列和日本晴序列，发现在Indel10 与Indel27之间191.1kb内共有31个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，进一步地根据数据库中公布的序列利用premer 5.0软件设计这些ORF的克隆引物，对6104与ssr1在这区间内的31个ORF 进行克隆、测序、比对。

克隆所用的PCR方法。PCR反应体系：1.0μL模板DNA，12.5μL 10×Buffer，5.0μL dNTP，0.5μL KOD FX，0.75μL PCR正向引物，0.75μL PCR反向引物，4.5μL ddH₂O(灭菌)。PCR反应程序：94 ℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，68℃延伸30s-3min(视扩增片段大小而定)，35个循环；循环结束后68℃总延伸10min。

配制1％的琼脂糖凝胶，在凝胶电泳仪中180V电场下电泳15min，采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。将回收产物送于湖南擎科生物技术有限公司进行测序。

使用DNAman7.0对测序结果进行比对，发现除Os10g0562700基因有一个单碱基缺失外，无其他变异。进一步对Os10g0562700基因序列比对分析，突变体在该基因转录起始位点后第3219碱基处缺失一个A碱基，该缺失发生在第四外显子上(图6)，蛋白序列分析比对显示，该突变造成移码突变，翻译过程被提前终止(图7、图8)。

实施例6突变位点分子标记设计与基因型鉴定

根据实施例5中得到的突变位点两侧的序列设计基因特异引物：

正向引物AS1-F 5′-AGCAGGCAGAGGAGATGAGAT-3′(SEQ ID NO:5)；

反向引物AS2-R 5′-TATGTCTCTGTCCGCTTTTTTATGTT-3′(SEQ ID NO:6)；

反向引物AS7-R 5′-CGTCAAGGGCTTCAACAACT-3′(SEQ ID NO:7)；

正向引物AS8-F 5′-TATCCCACAAGAGGCTTACACC-3′(SEQ ID NO:8)。

扩增所用的PCR反应体系：4.0μL模板DNA，10μL 2×GC Buffer，1.6μL dNTP，0.2μL rTaq酶， 0.2μL AS1-F，0.2μL AS2-R，0.2μL AS7-R，0.2μL AS8-F，3.4μL ddH₂O(灭菌)。PCR反应程序： 94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应，16℃保存。

配制3％的琼脂糖凝胶，向扩增产物中加入4μL 5×Loading Buffer，混匀后上样，200V电场下电泳20min，再用凝胶电泳成像仪观察并拍照记录。

结果见图9，实心杆突变体材料PCR结果为514bp和365bp两条带；野生型和其他材料PCR结果为515bp和192bp两条带，标记特异性较好，能够较好的区分等位基因差异。

实施例7基因型-突变表型共分离验证

在6122-617/ssr1的F₂群体中，随机挑取非突变型和突变体表型的植株各14株提取叶片DNA，提取方法同实施例4所述。用实施例7中所述的引物AS1-F、AS2-R、AS7-R、AS8-F进行扩增这些DNA 和亲本6122-617和突变体DNA，并按照实施例6中所述的电泳方法进行琼脂糖凝胶电泳。

电泳结果如图10和图11所示，表型为突变体植株扩增产物的电泳带型与突变体ssr1带型一致(图10)，表型为非突变型植株扩增产物的电泳带型为亲本6122-617带型或呈杂合型带型(图 11)。该结果表明突变表型是隐性性状，还表明实施例5中的突变位点与实心茎秆表型是共分离的。

实施例8蛋白结构预测

利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对Os10g0562700基因编码的氨基酸序列进行蛋白保守结构域预测，预测结果显示在第1-59位氨基酸处为DUF630未知功能的保守结构域、在第 324-632位氨基酸为DUF632未知功能的保守结构域，DUF630是一个在N末端含有植物bZIP家族蛋白的蛋白结构域，bZIP类转录因子含有与特异DNA序列相结合的碱性结构域，参与寡聚化作用的亮氨酸拉链区与碱性区紧密相连；DUF632是含有亮氨酸拉链结构的保守结构域，亮氨酸拉链 (leucine zipper)是由伸展的氨基酸组成，每7个氨基酸中的第7个氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当2个蛋白质分子平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成"拉链"。在"拉链"式的蛋白质分子中，亮氨酸以外带电荷的氨基酸形式同DNA结合。Os10g0562700基因很有可能是新的转录因子。

对比WT和ssr1的Os10g0562700基因蛋白结构域，发现在保守结构区域野生型和ssr1并没有差异，但是ssr1在DUF632结构域后非保守区域缺失了122个氨基酸(图12)，用PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)分析预测WT和ssr1的Os10g0562700基因蛋白二级结构，预测结果显示WT所编码的蛋白α-螺旋(H)占48.1％，不存在β-折叠(E)，故其属于全α型蛋白 (图13)；ssr1编码的蛋白α-螺旋(H)占43.2％，不存在β-折叠(E)(图14)。对比两者的结构显示，ssr1较野生型少了一段含有α-螺旋的氨基酸片段，这影响了蛋白质的构象，可能导致蛋白功能丧失或改变。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司湖南隆平高科种业科学研究院有限公司湖南亚华种业科学研究院

<120> 水稻Os10g0562700基因及其突变体基因ssr1与应用

<130> KHP171117075.0

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3999

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

agctgcagct cactcctccc actcgagtag agcagccaac tcctctctct ctctctcgcc 60

gcagcgagga gggagacgac ggcgaatcgg agagggcgtt agatcgaatc ggagaggagg 120

ggaagcgcgc gcgcgcgctc gcgtcgcggg tggggggcga tggggtgcac ggcgtcgaag 180

gtggagcagg aggacacggt gcggcggtgc aaggagcggc ggcggcacat gaaggaggcg 240

gtggcgtcgc ggcagcagct ggcgtcggcg cacgccgact acctccgctc cctccgcctc 300

accgccgccg cgctctcccg cttcgcgcag ggccacccgt cgctcgccgt gtcgcaccac 360

accgcgccgg tgctcctcac cacggccgcg cccgcgctgg cgccgacgcc gacgccgccg 420

ccgccgtcat ccacggcgtc gtcctcgctc ccgccaccga cgccgctgct ccccaagcac 480

cagcaggcgc cgccgccgcc accgcccacg cagtcgcatc agccgcctcc tcccgtggcg 540

gtgagggctc cccgcggcgg gccgcgtcgc ctcaaggtgc cgcacatcct gtccgactcc 600

agcgtcgcca gcccggcgcg gtcgtcgttc cggaagccgg tggtggggac gccgtcgtcg 660

tcgtcggcgt gggactggga gaacttctac ccgccgtcgc cgccggactc cgagttcttc 720

gaccgccgca aggccgacct cgaggaggcc aaccgcctcc gcgagctcga ggaggaggag 780

aaggcccggg gctacctcca cccccaccac ctcaaggaag aggacgaggt cgacgacgac 840

gacgacgaga gggaggagga gatgcattgc ggcggatggg aggacgacga cgaccactac 900

gcgtcgacga ccacctcgga gaccagatcg gaggaggggg aaatggggaa cagatcggag 960

tgcggcttcg cggccagatc ggagtacggc ggcacggcgc cgtcggagta cgccgccgcg 1020

ccgctgccac tgccgctgag gaggagggac gagaggtcgg aggccgggga ctcctcctcc 1080

acggtcacgg cggccgccga gatgcggatg gtgatccgcc accgcacgct ggcggagatc 1140

gtggccgcca tcgaggagta ctttgtcaag gcggccgagg ccggcaatgg cgtctcggag 1200

ctcctggagg ctagccgcgc gcagctggac cgcaacttcc ggcagctcaa aagtaatcag 1260

agattcatag cagacatatt atgcttgaac aaaaactata atgtggtttg aattggtgtg 1320

gcaatgtaca tttttagtga aaaaacgcaa gcaattgctt aacaatttca cttaatttga 1380

cttcttcttt tgcagagacg gtgtaccact cgaacagctt gctatcgtcg ctgtcgtcga 1440

catggacttc aaagccacca ttggctgttc gctacaagtt ggacaccaat gcgttagaga 1500

tggagtcaat ggaagggaag agccatgggt cgacactgga gcgtcttttg gcctgggaga 1560

aaaagctcta tcaggaggtc aaggtaattc tgctcatcga cgcttgatta caatgccatt 1620

cttgactgct ggttagtggt tatacttaat agatgagcac accactaaaa ttgaggtgtt 1680

tgtttgctgt gacatttttt gttgcacgcc tcaatcattc gttgtcggtg aagcatcttc 1740

aaactattca cttggctcca cttgaaaatt atccagctat atatatttgc tagagcatag 1800

tagtggacta accgataatt taggtcactg cacaacttta gcagcaatgc aagtttaatg 1860

aggtgtaatc ttctagtagc cacccttgtt ggatgctaga atagaatgca tgaactgttg 1920

cacttggcat tgcagcatag gcctacctag cagtcaaata atcaaggatg aattgaggct 1980

aactttaaca cttctggtgt agcttctaat cgattaggtg aagcttcacc tcatttgaaa 2040

ttggtgtttt gagcagcccg ccttttgttc agcaaatgtg gtagaagaat ctgattctat 2100

tgcataaagc gtctttacag aggtcctgca cttgcctacc ctggattctg aaacagctgt 2160

agcatttggt tgataatttt tcactacttt cagtaaagga agcaggcaca atacatggcc 2220

attgatctct caaccacacc ttcatatacc cttcctttat gctcttttta tatctaaact 2280

actcctgtcc tttgagattc tttgtggctt tgtgggtgaa ggtttagatc ctcaagaaat 2340

tgtctttact gcacataaat atacctcata atgccaaagg tagatttagc gtatctatgt 2400

ctaaagcacc agagtccaga gatgtttagg cctttagggg cattaccctt ggtaggcatg 2460

agacttatac catatctatt cgataattga gtgagactaa ccaatgttct ttttatttct 2520

gcaatctaga acataatgga ttcttactgt ccggtgtcta ctaaatgctt ctattctcta 2580

agcagtttat gaaactttat tgaaactatt cccatatgta ttaacttttt actgcttcag 2640

gctagagaga gcgttaagat tgagcacgag aagaagcttt ctactctgca gagcctggag 2700

tacagaggga gggatagtac caagctggat aagaccaagg cctccataaa caagctgcaa 2760

tcgttgatca tcgtgacttc acaggccgca actaccacat cctcagccat tgtcagggtg 2820

cgtgacaatg agcttgcacc acagcttgtc gagctttgct tcgcgtaaga cttgttccct 2880

gttctgacat ctatgatacc agattttgcg acattgtgtg caagtattta aattgtatct 2940

gaatattgat atgcaggctg ttgagcatgt ggagatcaat gaaccatttc catgagatcc 3000

agaatgaaat tgttcagcaa gtccgtggtc tggtagacaa ttccatggct gagtcaacat 3060

ctgatcttca ccggcttgcc acccgtgatc ttgaggctgc tgtctcagca tggcactcaa 3120

acttcaaccg tctcatcaag tatcaacgtg attatatacg tgccctctat ggctggctga 3180

agctcacact cttccaagtg gacagtaata tcccacaaga ggcttacacc tcgctgatct 3240

ctcgtgaact caccaccttc tgtgatgagt ggaagcaagc actggaccgg cttccagatg 3300

cttcggcttc ggaggctatc aagagcttcg tgaatgttgt ccatgtcatc tacactaagc 3360

aggcagagga gatgaaataa aaaagcggac agagacatat tcaaaggagc tggaaaagaa 3420

gaccaactca cttcgagcca ttgagaagaa gtactaccaa tcctattcaa tggttggcct 3480

tggccttcct ggcagtgggc gcgatggcat tgaaagccat tcgttcgatg cccgcgatcc 3540

tcttgcagag aagaaaaccg agattgccca atgtcggcgg aaggtggagg acgaaatgac 3600

aaggcatgct aaggcagtgg aggtaactag atcaatgaca ctgaacaaca tccaaacagg 3660

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tatagctaaa attagtgatg agaatatggg ggagaaggct cccttgatgt tttgccttgt 3900

tgggagttgg tcattttggt tgtagataaa tgattttact caggattgtt gatgttcttt 3960

tgcttgtcct gtgaagtgca agggaagatt acattgtac 3999

<210> 2

<211> 642

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Gly Cys Thr Ala Ser Lys Val Glu Gln Glu Asp Thr Val Arg Arg

1 5 10 15

Cys Lys Glu Arg Arg Arg His Met Lys Glu Ala Val Ala Ser Arg Gln

20 25 30

Gln Leu Ala Ser Ala His Ala Asp Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Leu Thr

35 40 45

Ala Ala Ala Leu Ser Arg Phe Ala Gln Gly His Pro Ser Leu Ala Val

50 55 60

Ser His His Thr Ala Pro Val Leu Leu Thr Thr Ala Ala Pro Ala Leu

65 70 75 80

Ala Pro Thr Pro Thr Pro Pro Pro Pro Ser Ser Thr Ala Ser Ser Ser

85 90 95

Leu Pro Pro Pro Thr Pro Leu Leu Pro Lys His Gln Gln Ala Pro Pro

100 105 110

Pro Pro Pro Pro Thr Gln Ser His Gln Pro Pro Pro Pro Val Ala Val

115 120 125

Arg Ala Pro Arg Gly Gly Pro Arg Arg Leu Lys Val Pro His Ile Leu

130 135 140

Ser Asp Ser Ser Val Ala Ser Pro Ala Arg Ser Ser Phe Arg Lys Pro

145 150 155 160

Val Val Gly Thr Pro Ser Ser Ser Ser Ala Trp Asp Trp Glu Asn Phe

165 170 175

Tyr Pro Pro Ser Pro Pro Asp Ser Glu Phe Phe Asp Arg Arg Lys Ala

180 185 190

Asp Leu Glu Glu Ala Asn Arg Leu Arg Glu Leu Glu Glu Glu Glu Lys

195 200 205

Ala Arg Gly Tyr Leu His Pro His His Leu Lys Glu Glu Asp Glu Val

210 215 220

Asp Asp Asp Asp Asp Glu Arg Glu Glu Glu Met His Cys Gly Gly Trp

225 230 235 240

Glu Asp Asp Asp Asp His Tyr Ala Ser Thr Thr Thr Ser Glu Thr Arg

245 250 255

Ser Glu Glu Gly Glu Met Gly Asn Arg Ser Glu Cys Gly Phe Ala Ala

260 265 270

Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Thr Ala Pro Ser Glu Tyr Ala Ala Ala Pro

275 280 285

Leu Pro Leu Pro Leu Arg Arg Arg Asp Glu Arg Ser Glu Ala Gly Asp

290 295 300

Ser Ser Ser Thr Val Thr Ala Ala Ala Glu Met Arg Met Val Ile Arg

305 310 315 320

His Arg Thr Leu Ala Glu Ile Val Ala Ala Ile Glu Glu Tyr Phe Val

325 330 335

Lys Ala Ala Glu Ala Gly Asn Gly Val Ser Glu Leu Leu Glu Ala Ser

340 345 350

Arg Ala Gln Leu Asp Arg Asn Phe Arg Gln Leu Lys Lys Thr Val Tyr

355 360 365

His Ser Asn Ser Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Thr Trp Thr Ser Lys

370 375 380

Pro Pro Leu Ala Val Arg Tyr Lys Leu Asp Thr Asn Ala Leu Glu Met

385 390 395 400

Glu Ser Met Glu Gly Lys Ser His Gly Ser Thr Leu Glu Arg Leu Leu

405 410 415

Ala Trp Glu Lys Lys Leu Tyr Gln Glu Val Lys Ala Arg Glu Ser Val

420 425 430

Lys Ile Glu His Glu Lys Lys Leu Ser Thr Leu Gln Ser Leu Glu Tyr

435 440 445

Arg Gly Arg Asp Ser Thr Lys Leu Asp Lys Thr Lys Ala Ser Ile Asn

450 455 460

Lys Leu Gln Ser Leu Ile Ile Val Thr Ser Gln Ala Ala Thr Thr Thr

465 470 475 480

Ser Ser Ala Ile Val Arg Val Arg Asp Asn Glu Leu Ala Pro Gln Leu

485 490 495

Val Glu Leu Cys Phe Ala Leu Leu Ser Met Trp Arg Ser Met Asn His

500 505 510

Phe His Glu Ile Gln Asn Glu Ile Val Gln Gln Val Arg Gly Leu Val

515 520 525

Asp Asn Ser Met Ala Glu Ser Thr Ser Asp Leu His Arg Leu Ala Thr

530 535 540

Arg Asp Leu Glu Ala Ala Val Ser Ala Trp His Ser Asn Phe Asn Arg

545 550 555 560

Leu Ile Lys Tyr Gln Arg Asp Tyr Ile Arg Ala Leu Tyr Gly Trp Leu

565 570 575

Lys Leu Thr Leu Phe Gln Val Asp Ser Asn Ile Pro Gln Glu Ala Tyr

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Thr Ser Leu Ile Ser Arg Glu Leu Thr Thr Phe Cys Asp Glu Trp Lys

595 600 605

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Ser Phe Val Asn Val Val His Val Ile Tyr Thr Lys Gln Ala Glu Glu

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Met Lys

<210> 3

<211> 4000

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

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