蛋白质组合物、其制造方法和热稳定性提高方法与流程

本发明涉及蛋白质组合物、其制造方法和热稳定性提高方法。

背景技术：

发挥以蛛丝为代表的结构蛋白质的原材料的优越性，进行了新型原材料的设计、制造和工业用材料化工艺的研究。在着眼于产业化的材料开发中，耐劣化性(耐久性)、稳定性变得重要，特别是关于蛋白质的热劣化，由于劣化机制的不明确性等原因，难以进行稳定剂的选择。另外，关于稳定剂，虽然存在很多有关疏水性树脂的见解，但是对于性质与疏水性树脂完全不同的蛋白质，目前尚处于不清楚有效的稳定剂的分子结构及其添加工艺的状态。需要说明的是，关于天然蛛丝的耐热性，例如在非专利文献1中有记载。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：蛋白质核酸酶vol.41,no.14(1996)

技术实现要素：

发明所要解决的问题

因此，本发明的课题在于提供热稳定性提高的蛋白质组合物、其制造方法和蛋白质的热稳定性提高方法。

用于解决问题的方法

本发明提供一种蛋白质组合物(蛋白质组合物1)，其为含有蛋白质分散在稳定剂溶液中而成的分散体的干燥物的蛋白质组合物，其中，上述稳定剂包含选自由邻苯二酚类稳定剂、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸、2,6-二叔丁基对甲酚、2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)组成的组中的至少一种。

另外，本发明提供一种蛋白质组合物(蛋白质组合物2)，其为含有溶解有蛋白质和稳定剂的溶液的干燥物的蛋白质组合物，其中，上述稳定剂包含选自由n,n’-己烷-1,6-二基双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺)、1,6-己二醇双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸酯]、6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)、2,6-二叔丁基对甲酚、3,9-双(2,6-二叔丁基-4-甲基苯氧基)-2,4,8,10-四氧杂-3,9-二磷杂螺[5.5]十一烷、聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]]]、α-生育酚、3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯和4,4’,4”-(1-甲基丙基-3-亚基)三(6-叔丁基间甲酚)组成的组中的至少一种。

蛋白质组合物1和2分别可以利用下述的制造方法1和2得到。

制造方法1：一种制造方法，其为包括下述工序的蛋白质组合物的制造方法：使蛋白质分散在稳定剂溶液中而得到分散体的工序；和从该分散体中除去挥发成分而得到干燥物的工序，上述稳定剂包含选自由邻苯二酚类稳定剂、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸、2,6-二叔丁基对甲酚、2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)组成的组中的至少一种。

制造方法2：一种制造方法，其为包括下述工序的蛋白质组合物的制造方法：将蛋白质、该蛋白质的溶解溶剂和稳定剂溶液混合而得到混合溶液的工序；和从该混合溶液中除去挥发成分而得到干燥物的工序，上述稳定剂包含选自由n,n’-己烷-1,6-二基双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺)、1,6-己二醇双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸酯]、6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)、2,6-二叔丁基对甲酚、3,9-双(2,6-二叔丁基-4-甲基苯氧基)-2,4,8,10-四氧杂-3,9-二磷杂螺[5.5]十一烷、聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]]]、α-生育酚、3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯和4,4’,4”-(1-甲基丙基-3-亚基)三(6-叔丁基间甲酚)组成的组中的至少一种。

蛋白质组合物1和2均显示出高的热稳定性，因此能够作为产业材料有效地发挥作用。即，本发明提供下述的方法1和2这样的蛋白质的热稳定性提高方法。

方法1：一种热稳定性提高方法，其为蛋白质的热稳定性提高方法，其中，使上述蛋白质分散在溶解有选自由邻苯二酚类稳定剂、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸、2,6-二叔丁基对甲酚、2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)组成的组中的至少一种化合物的溶液中，得到分散体，从该分散体中除去挥发成分，得到共存有上述蛋白质和上述化合物的干燥物。

方法2：一种热稳定性提高方法，其为蛋白质的热稳定性提高方法，其中，将上述蛋白质、该蛋白质的溶解溶剂与选自由n,n’-己烷-1,6-二基双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺)、1,6-己二醇双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸酯]、6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)、2,6-二叔丁基对甲酚、3,9-双(2,6-二叔丁基-4-甲基苯氧基)-2,4,8,10-四氧杂-3,9-二磷杂螺[5.5]十一烷、聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]]]、α-生育酚、3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯和4,4’,4”-(1-甲基丙基-3-亚基)三(6-叔丁基间甲酚)组成的组中的至少一种化合物的溶液混合，得到混合溶液，从该混合溶液中除去挥发成分，得到共存有上述蛋白质和上述化合物的干燥物。

发明效果

根据本发明，提供热稳定性提高的蛋白质组合物、其制造方法和蛋白质的热稳定性提高方法。

附图说明

图1是加压成形机的示意性截面图。

图2(a)是组合物导入前的加压成形机的示意性截面图，图2(b)是组合物刚导入后的加压成形机的示意性截面图，图2(c)是对组合物进行加热和加压的状态的加压成形机的示意性截面图。

具体实施方式

以下，对本发明的优选实施方式进行说明。但是，本发明并不受下述实施方式的任何限定。

第一实施方式的蛋白质组合物(蛋白质组合物1)为含有蛋白质分散在稳定剂溶液中而成的分散体的干燥物的蛋白质组合物，稳定剂包含选自由邻苯二酚类稳定剂、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸、2,6-二叔丁基对甲酚、2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)组成的组中的至少一种。

上述邻苯二酚类稳定剂可以为选自由2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-三羟基-4h-色烯-4-酮、(1s,3r,4r,5r)-3-{[3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰]氧基}-1,4,5-三羟基环己烷-1-羧酸、2-(3,4-二羟基苯基)-5,7-二羟基-3-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-三羟基-6-({[(2r,3r,4r,5r,6s)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢吡喃-2-基]氧基}甲基)四氢吡喃-2-基]氧基}-4h-色烯-4-酮、3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯和4,4’-(2,3-二甲基丁烷-1,4-二基)二苯-1,2-二醇组成的组中的至少一种。以下，将这些稳定剂与6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸、2,6-二叔丁基对甲酚、2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)合称为“第一实施方式用稳定剂”。

蛋白质组合物1中，相对于蛋白质100质量份，第一实施方式用稳定剂的含量优选大于0质量份且为10质量份以下，更优选0.001质量份以上且10质量份以下，更优选0.01质量份以上且5质量份以下，更优选0.1质量份以上且2质量份以下，更优选0.1质量份以上且1质量份以下，进一步优选0.1质量份以上且0.5质量份以下。这是由于，即使增加含量而超过10质量份，与之相应的热稳定性的提高也变小。蛋白质组合物1例如可以通过包括下述工序的制造方法进行制造(上述制造方法1)：使蛋白质分散在第一实施方式用稳定剂的溶液中而得到分散体的工序；和从该分散体中除去挥发成分而得到干燥物的工序。蛋白质组合物1也可以为将干燥物溶解在溶剂等中而得到的溶液或者将干燥物分散在溶剂等中而得到的分散体。

需要说明的是，蛋白质组合物1可以仅由上述干燥物构成，也可以含有其他成分。即，蛋白质组合物1中可以含有蛋白质和稳定剂以外的其他成分。另外，在得到该蛋白质组合物1时，可以使其他成分溶解在溶剂中，也可以添加在分散体或干燥物中。

作为用于制造第一实施方式用稳定剂的溶液的溶剂，可以列举乙醇、甲醇等伯醇、2-丙醇等仲醇、叔丁醇等叔醇、丙酮、甲乙酮、二氯甲烷等单一溶剂、或者这些溶剂中的至少两种的混合溶剂等。作为该溶剂，优选二氯甲烷，更优选体积比1/1的丙酮/甲醇的混合溶剂，进一步优选甲醇。认为这是由于，溶剂与蛋白质的相容性越高，使稳定剂侵入到蛋白质分子内的效果越高，越可提高热稳定性效果。该溶液中的第一实施方式用稳定剂的浓度例如为0.1～1mg/ml。

为了得到分散体，蛋白质优选为粉末状。另外，优选按照蛋白质与第一实施方式用稳定剂的上述优选比率在第一实施方式用稳定剂的溶液中添加蛋白质。在这样得到的分散体中，第一实施方式用稳定剂溶解在溶剂中，蛋白质分散在溶剂中。添加后，可以进一步搅拌后进行干燥而得到蛋白质组合物1。需要说明的是，搅拌时间没有特别限定，可以列举例如室温下16～60小时或16～24小时等。干燥方法也没有特别限定，可以列举例如自然干燥(例如25℃、1个大气压)或减压干燥(例如40℃下4小时)等。

这样得到的蛋白质组合物典型地为粉末状或膜状。另外，该蛋白质组合物的干燥物可以为成形体(模压成形体等)。作为成形体的一种的模压成形体的制造例如下所述。

即，模压成形体可以通过将蛋白质组合物1导入到铸模(模具)中进行成形加工等而得到，成形加工的工序中，可以进行加热和加压。作为成形加工对象的蛋白质组合物1可以具有粉末状(冷冻干燥粉末等)或纤维状(纺丝得到的纤维等)的形状。另外，模压成形体可以为上述形状的蛋白质组合物的熔融体。

利用图对使用加压成形机(铸模)制作模压成形体的方法进行说明。图1所示的加压成形机10具备形成有贯通孔且可进行加热的模具2、以及能够在模具2的贯通孔内上下移动的上侧销4和下侧销6，在向模具2中插入上侧销4或下侧销6而产生的空隙内导入蛋白质组合物，一边对模具2进行加热，一边利用上侧销4和下侧销6对组合物进行压缩，从而能够制造模压成形体。

如图2(a)所示，在模具2的贯通孔中仅插入有下侧销6的状态下向贯通孔内导入蛋白质组合物，如图2(b)所示，向模具2的贯通孔中插入上侧销4并使其下降，开始模具2的加热，在贯通孔内对加热加压前的蛋白质组合物8a进行加热加压。使上侧销4下降至达到预先规定的加压力为止，在图2(c)所示的状态下继续加热和加压直至蛋白质组合物达到规定的温度为止，得到加热加压后的蛋白质组合物8b。然后，使用冷却器(例如点式制冷机)使模具2的温度下降，在蛋白质组合物8b达到规定的温度时，从模具2中拔出上侧销4或下侧销6，取出内容物，得到模压成形体。关于加压，可以在将下侧销6固定的状态下使上侧销4下降来实施，也可以实施上侧销4的下降和下侧销6的升高这两者。

加热优选在80～300℃进行，更优选为100～200℃，进一步优选为130～200℃。加压优选以5kn以上进行，更优选为10kn以上，进一步优选为20kn以上。另外，在达到规定的加热加压条件后，在该条件下继续处理的时间(保温条件)优选为0～100分钟，更优选为1～50分钟，进一步优选为5～30分钟。

在第一实施方式的蛋白质组合物含有3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯或6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)作为稳定剂的情况下，该蛋白质组合物的干燥物(例如模压成形体)的弯曲强度更优良。

第二实施方式的蛋白质组合物(蛋白质组合物2)为含有溶解有蛋白质和稳定剂的溶液的干燥物的蛋白质组合物，其中，稳定剂包含选自由n,n’-己烷-1,6-二基双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺)、1,6-己二醇双[3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸酯]、6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)、2,6-二叔丁基对甲酚、3,9-双(2,6-二叔丁基-4-甲基苯氧基)-2,4,8,10-四氧杂-3,9-二磷杂螺[5.5]十一烷、聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]]]、α-生育酚、3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯和4,4’,4”-(1-甲基丙基-3-亚基)三(6-叔丁基间甲酚)组成的组中的至少一种。以下，将这些稳定剂称为“第二实施方式用稳定剂”。

关于优选的第二实施方式用稳定剂，优选为：

3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯和2,2’-亚甲基双(4,6-二叔丁基苯基)2-乙基己基亚磷酸酯的组合、

6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)和硫代双[2-(1,1-二甲基乙基)-5-甲基-4,1-亚苯基]-双[3-(十二烷基硫代)丙酸酯]的组合、

n,n’-己烷-1,6-二基双(3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺))和2,2’-亚甲基双(4,6-二叔丁基苯基)2-乙基己基亚磷酸酯的组合、

聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]])和3,9-双(2,6-二叔丁基-4-甲基苯氧基)-2,4,8,10-四氧杂-3,9-二磷杂螺[5.5]十一烷的组合、或者

聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]])和2,2’-亚甲基双(4,6-二叔丁基苯基)2-乙基己基亚磷酸酯的组合、或者

聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]])和硫代双[2-(1,1-二甲基乙基)-5-甲基-4,1-亚苯基]双[3-(十二烷基硫代)丙酸酯]的组合。

稳定剂为上述组合中的任意一者时，含有该稳定剂的蛋白质组合物的热稳定性进一步提高。

蛋白质组合物2中，相对于蛋白质100质量份，稳定剂的含量优选大于0质量份且为10质量份以下，更优选为0.001质量份以上且10质量份以下，更优选为0.01质量份以上且5质量份以下，更优选为0.1质量份以上且2质量份以下，更优选为0.1质量份以上且1质量份以下，进一步优选为0.1质量份以上且0.5质量份以下。这是由于，即使增加含量而超过10质量份，与之相应的热稳定性的提高也变小。蛋白质组合物2例如可以通过包括下述工序的制造方法进行制造(上述制造方法2)：将蛋白质、该蛋白质的溶解溶剂和第二实施方式用稳定剂的溶液混合而得到混合溶液的工序；和从该混合溶液中除去挥发成分而得到干燥物的工序。另外，蛋白质组合物2也可以为将干燥物溶解在溶剂等中而得到的组合物。

需要说明的是，蛋白质组合物2可以仅由上述干燥物构成，也可以含有其他成分。即，蛋白质组合物2中可以含有蛋白质和稳定剂以外的其他成分。另外，在得到该蛋白质组合物2时，可以使其他成分溶解在溶剂中。

作为蛋白质的溶解溶剂，只要能够溶解蛋白质即可，可以列举例如氯化钙/乙醇/水的混合溶剂、dmso、hfip、甲酸等。溶解溶剂的添加量为能够溶解蛋白质的量，例如优选以蛋白质的量为10～24质量％的方式进行调节。

作为用于制造第二实施方式用稳定剂的溶液的溶剂，可以列举乙醇、甲醇等伯醇、2-丙醇等仲醇、叔丁醇等叔醇、丙酮、甲乙酮、二氯甲烷等单一溶剂、或者这些溶剂中的至少两种的混合溶剂等。第二实施方式用稳定剂的浓度以稳定剂在蛋白质的溶解溶剂中的溶解度为上限。

为了得到混合溶液，蛋白质优选为粉末状。另外，优选按照蛋白质与第二实施方式用稳定剂的上述优选比率来制造混合溶液。混合溶液例如可以将蛋白质、蛋白质的溶解溶剂、第二实施方式用稳定剂混合并在65℃±5℃下搅拌3～6小时来制备。这样得到的混合溶液(混杂溶液，dopesolution)溶解有蛋白质和第二实施方式用稳定剂这两者。

蛋白质组合物2的干燥物典型地为非粉末状(膜状、纤维状、绳状、板状等)。蛋白质组合物2的干燥物可以为成形体(膜、板、纤维、绳等)。例如，可以将上述得到的混合溶液(混杂溶液)浇注到聚苯乙烯制的基板上，进行减压干燥(例如60℃、0.54个大气压下7天)而成形。然后，在丙酮、甲醇混合溶液(比率7:3)中浸渍30分钟，进一步在甲醇溶液中浸渍30分钟后，自然干燥(例如25℃、1个大气压)，得到蛋白质组合物2的干燥物(膜状或板状)。另外，可以通过对上述得到的混合溶液(混杂溶液)进行纺丝而得到蛋白质组合物2的干燥物(纤维状或绳状)。

通过进行上述制造方法1和2，能够使该蛋白质与稳定剂共存，由此能够提高蛋白质的热稳定性。即，提供下述热稳定性提高方法：一种热稳定性提高方法，使蛋白质分散在第一实施方式用稳定剂溶解而成的溶液中，得到分散体，从该分散体中除去挥发成分，得到共存有蛋白质和化合物的干燥物(上述方法1)；以及一种热稳定性提高方法，将蛋白质、该蛋白质的溶解溶剂和第二实施方式用稳定剂的溶液混合，得到混合溶液，从该混合溶液中除去挥发成分，得到共存有蛋白质和化合物的干燥物(上述方法2)。

蛋白质组合物1和2的热稳定性的评价方法可以利用通常使用的方法进行。可以列举例如化学发光法、差热-热重同步测定(tg-dta)、差示扫描量热测定(dsc)、高压差示扫描量热测定(hp-dsc)、加速绝热量热法(arc)、或者拉伸试验、弯曲试验(例如弯曲强度试验)、压缩试验、冲击试验等机械强度试验等各种方法。

化学发光法是通过检测由热氧化劣化产生的微弱的化学发光(chemiluminescence)来进行劣化评价的分析方法。化学发光是指通过在物质的化学反应时分子从激发态恢复至基态而产生的光，聚合物的劣化中的化学发光据称是由自氧化劣化产生的激发羰基降至基底状态时所产生的。导入有稳定剂的聚丙烯这样的烯烃类高分子化合物的情况下，在稳定剂发挥效力的期间，几乎没有来自材料的发光，但当稳定剂耗尽时，自氧化劣化急剧进行，由此观测到化学发光。将这样直到稳定剂丧失效力、物质发光为止的时间称为氧化诱导期(oit)，该时间成为表示物质的稳定性的指标。另一方面，对于聚酰胺6这样的一部分非烯烃类高分子化合物而言，不存在oit，显现出下述行为：发光强度伴随加热而缓慢升高，在显示出最大值后减少。在使这样的材料稳定化的情况下，观测到发光强度的减少以及达到最大值为止的时间的延迟(extentionoftimeatimax[％])，因此可以将其视为稳定性的指标。

第一实施方式和第二实施方式中，蛋白质的种类均没有特别限定。可以是利用基因重组技术在微生物等中制造的蛋白质，也可以是通过合成制造的蛋白质，另外也可以是对天然来源的蛋白质进行纯化而得到的蛋白质。

蛋白质例如可以为结构蛋白质。结构蛋白质是指在生物体内对结构、形态等进行形成或保持的蛋白质。作为这样的结构蛋白质，可以列举例如丝心蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白等。这些蛋白质可以单独或适当组合而用作结构蛋白质。

丝心蛋白例如可以为选自由蚕丝丝心蛋白、蛛丝丝心蛋白和蜂丝丝心蛋白组成的组中的一种以上。特别是结构蛋白质可以为蚕丝丝心蛋白、蛛丝丝心蛋白或它们的组合。在组合使用蚕丝丝心蛋白和蛛丝丝心蛋白的情况下，相对于蛛丝丝心蛋白100质量份，蚕丝丝心蛋白的比例例如可以为40质量份以下、30质量份以下或10质量份以下。

蚕丝是由作为家蚕(bombyxmori)幼虫的蚕所形成的茧得到的纤维(茧丝)。通常，1根茧丝由2根蚕丝丝心蛋白和从外侧包覆它们的胶质(丝胶蛋白)构成。蚕丝丝心蛋白由很多原纤维构成。蚕丝丝心蛋白被4层丝胶蛋白包覆。实际使用中，通过精炼将外侧的丝胶蛋白溶解去除，所得到的真丝长丝用于衣料用途中。一般的蚕丝具有1.33的比重、平均3.3分特克斯(decitex)的纤度和约1300m～约1500m的纤维长度。蚕丝丝心蛋白以野生或家蚕的茧或者旧的或废弃的丝绸料作为原料而得到。

蚕丝丝心蛋白可以为除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白、未除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白、或者它们的组合。除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白是除去包覆蚕丝丝心蛋白的丝胶蛋白和其他脂肪成分等并进行纯化而得到的蚕丝丝心蛋白。这样纯化的蚕丝丝心蛋白优选以冷冻干燥粉末的形式使用。未除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白是丝胶蛋白等未被除去的未纯化的蚕丝丝心蛋白。

蛛丝丝心蛋白可以含有选自由天然蛛丝蛋白和来源于天然蛛丝蛋白的多肽组成的组中的蛛丝多肽。

作为天然蛛丝蛋白，可以列举例如大吐丝管牵引丝蛋白、横丝蛋白和小壶状腺蛋白。大吐丝管牵引丝具有由结晶区域和非晶区域(也称为定形区域)构成的重复区域，因此兼具高的应力和伸缩性。蛛丝的横丝具有下述特征：不具有结晶区域，而具有由非晶区域构成的重复区域。与大吐丝管牵引丝相比，横丝的应力差，但具有高伸缩性。

大吐丝管牵引丝蛋白在蜘蛛的大壶状腺中产生，具有强韧性优良的特征。作为大吐丝管牵引丝蛋白，可以列举例如来源于金纺蜘蛛(nephilaclavipes)的大壶状腺丝蛋白masp1和masp2、以及来源于十字园蛛(araneusdiadematus)的adf3和adf4。adf3是十字园蛛的两种主要的牵引丝蛋白之一。来源于天然蛛丝蛋白的多肽可以为来源于这些牵引丝蛋白的多肽。来源于adf3的多肽比较容易合成，并且在强伸度和韧性方面具有优良的特性。

横丝蛋白在蜘蛛的鞭状腺(flagelliformgland)中产生。作为横丝蛋白，可以列举例如来源于金纺蜘蛛(nephilaclavipes)的鞭状丝蛋白(flagelliformsilkprotein)。

来源于天然蛛丝蛋白的多肽可以为重组蛛丝蛋白。作为重组蛛丝蛋白，可以列举天然型蛛丝蛋白的突变体、类似物或衍生物等。这样的多肽的优选的一例为大吐丝管牵引丝蛋白的重组蛛丝蛋白(也称为“来源于大吐丝管牵引丝蛋白的多肽”)。

作为丝心蛋白样蛋白质的、来源于大吐丝管牵引丝的蛋白质或来源于蚕丝的蛋白质可以列举例如包含式1：[(a)n基序-rep1]m所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式1中，(a)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(a)n基序中丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上。rep1表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示8～300的整数。两个以上存在的(a)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的rep1彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号1所表示的氨基酸序列的蛋白质。

作为来源于横丝蛋白的蛋白质，可以列举例如包含式2：[rep2]o所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式2中，rep2表示由gly-pro-gly-gly-x构成的氨基酸序列，x表示选自由丙氨酸(ala)、丝氨酸(ser)、酪氨酸(tyr)和缬氨酸(val)组成的组中的一种氨基酸。o表示8～300的整数。)。具体而言，可以列举包含序列号2所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号2所表示的氨基酸序列是将由ncbi数据库获得的金纺蜘蛛的鞭状丝蛋白的部分序列(ncbi登记号：aaf36090、gi：7106224)的相当于重复部分和基序的n末端起第1220位残基至第1659位残基为止的氨基酸序列(记作pr1序列)与由ncbi数据库获得的金纺蜘蛛的鞭状丝蛋白的部分序列(ncbi登记号：aac38847、gi：2833649)的c末端起第816位残基至第907位残基为止的c末端氨基酸序列结合，并在结合得到的序列的n末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。

作为来源于胶原蛋白的蛋白质，可以列举例如包含式3：[rep3]p所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式3中，p表示5～300的整数。rep3表示由gly-x-y构成的氨基酸序列，x和y表示gly以外的任意氨基酸残基。两个以上存在的rep3彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号3所表示的氨基酸序列是在由ncbi数据库获得的人iv型胶原蛋白的部分序列(ncbi的genbank的登记号：caa56335.1、gi：3702452)的相当于重复部分和基序的第301位残基至第540位残基为止的氨基酸序列的n末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。

作为来源于节肢弹性蛋白的蛋白质，可以列举例如包含式4：[rep4]q所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式4中，q表示4～300的整数。rep4表示由ser-j-j-tyr-gly-u-pro构成的氨基酸序列。j表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由asp、ser和thr组成的组中的氨基酸残基。u表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由pro、ala、thr和ser组成的组中的氨基酸残基。两个以上存在的rep4彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号4所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号4所表示的氨基酸序列是在节肢弹性蛋白(ncbi的genbank的登记号np611157、gl：24654243)的氨基酸序列中将第87位残基的thr置换为ser、并且将第95位残基的asn置换为asp的序列的第19位残基至第321位残基为止的氨基酸序列的n末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。

作为来源于弹性蛋白的蛋白质，可以列举例如具有ncbi的genbank的登记号aac98395(人)、i47076(绵羊)、np786966(牛)等的氨基酸序列的蛋白质。具体而言，可以列举包含序列号5所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号5所表示的氨基酸序列是在ncbi的genbank的登记号aac98395的氨基酸序列的第121位残基至第390位残基为止的氨基酸序列的n末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。

在蛋白质原料纤维中作为主要成分含有的蛋白质例如可以通过下述方法进行生产：利用具有编码该蛋白质的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列的表达载体对宿主进行转化，利用转化后的宿主表达该核酸。

编码在蛋白质原料纤维中作为主要成分含有的蛋白质的基因的制造方法没有特别限制。例如，可以通过利用编码天然结构蛋白质的基因、利用聚合酶链式反应(pcr)等进行扩增而克隆的方法来制造基因；或者可以通过化学合成来制造基因。基因的化学合成方法也没有特别限制，例如可以利用下述方法对基因进行化学合成：基于由ncbi的网络数据库等获得的结构蛋白质的氨基酸序列信息，利用aktaoligopilotplus10/100(gehealthcarejapan株式会社)等自动合成寡核苷酸，利用pcr等将所合成的寡核苷酸连接。此时，为了易于进行蛋白质的纯化、确认，可以合成编码由在上述氨基酸序列的n末端附加由起始密码子和his10标签构成的氨基酸序列而得到的氨基酸序列构成的蛋白质的基因。

调节序列是对宿主中的重组蛋白的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。作为启动子，可以使用在宿主细胞中发挥功能、能够对目标蛋白质进行表达诱导的诱导性启动子。诱导性启动子是能够根据存在诱导物质(表达诱导剂)、不存在阻遏物分子、或者温度、渗透压或ph值的上升或降低等物理因素对转录进行调控的启动子。

表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人造染色体载体等。作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够并入到宿主的染色体中、且在能够对编码目标蛋白质的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。

作为宿主，原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物均可以优选使用。

作为原核生物的优选例，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属属和假单胞菌属等的细菌。作为属于埃希氏菌属的微生物，可以列举例如大肠杆菌(escherichiacoli)等。作为属于短芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如土壤短芽孢杆菌(brevibacillusagri)等。作为属于沙雷氏菌属的微生物，可以列举例如液化沙雷氏菌(serratialiquefacience)等。作为属于芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等。作为属于分枝杆菌属的微生物，可以列举例如嗜氨分枝杆菌(microbacteriumammoniaphilum)等。作为属于短杆菌属的微生物，可以列举例如叉开短杆菌(brevivacteriumdivaricatum)等。作为属于棒杆菌属的微生物，可以列举例如产氨棒杆菌(corynebacteriumammoniagenes等。作为属于假单胞菌(pseudomonas)属的微生物，可以列举例如恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)等。

作为导入编码在蛋白质原料纤维中作为主要成分含有的蛋白质的核酸的载体，可以列举例如pbtrp2(boehringermannheim公司制)、pgex(pharmacia公司制)、puc18、pbluescriptii、psupex、pet22b、pcold、pub110、pnco2(日本特开第2002-238569号公报)等。

作为真核生物的宿主，可以列举例如酵母和丝状真菌(霉菌等)。作为酵母，可以列举例如属于酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母等的酵母。作为丝状真菌，可以列举例如属于曲霉属、青霉属、木霉(trichoderma)属等的丝状真菌。

作为载体，可以列举例如yep13(atcc37115)、yep24(atcc37051)等。作为向上述宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是将dna导入上述宿主细胞中的方法则均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[proc.natl.acad.sci.usa,69,2110(1972)]、电穿孔法、原生质球法、原生质体法、乙酸锂法、感受态细胞法等。

作为利用以表达载体进行了转化的宿主的核酸的表达方法，除了直接表达以外，还可以依照分子克隆第2版中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白质表达等。

蛋白质例如可以通过将利用表达载体进行了转化的宿主在培养用培养基中培养，使该蛋白质在培养用培养基中生成蓄积，并从该培养用培养基中采集来制造。将宿主在培养用培养基中培养的方法可以按照宿主的培养中通常使用的方法进行。

在宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为培养用培养基，只要是含有宿主可同化的碳源、氮源和无机盐类等、能够高效地进行宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。

作为碳源，只要是上述转化微生物可同化的碳源即可，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、以及乙醇和丙醇等醇类。作为氮源，可以使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。作为无机盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。

大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的ph优选保持于3.0～9.0。培养用培养基的ph的调节可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨等进行。

另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。

蛋白质的分离、纯化可以利用通常使用的方法进行。例如，在该蛋白质以溶解状态在细胞内进行表达的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收宿主细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、manton-gaulin匀浆器和戴诺研磨机(dyno-mill)等将宿主细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过将该无细胞提取液离心分离而得到的上清中，单独或组合使用蛋白质的分离纯化中通常使用的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(deae)-琼脂糖、diaionhpa-75(三菱化成公司制)等树脂的阴离子交换层析法、使用s-琼脂糖ff(pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。

另外，在蛋白质在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，同样在回收宿主细胞后将其破碎并进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收改造丝心蛋白的不溶体。回收的改造丝心蛋白的不溶体可以利用蛋白变性剂进行可溶化。该操作后，利用与上述同样的分离纯化法能够得到改造丝心蛋白的纯化制备品。在该蛋白质被分泌到细胞外的情况下，可以从培养上清中回收该蛋白质。即，利用离心分离等方法对培养物进行处理，由此获得培养上清，通过使用与上述同样的分离纯化法，能够从该培养上清中得到纯化制备品。

需要说明的是，包含如上所述的蛋白质作为主要成分的蛋白质原料纤维利用公知的方法进行制造。即，例如在制造包含蛛丝丝心蛋白的蛋白质原料纤维时，首先，使用利用上述表达载体进行了转化的宿主等制造蛛丝丝心蛋白，将所制造的蛛丝丝心蛋白单独地溶解在二甲亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、甲酸或六氟异丙醇(hfip)等溶剂中而制作混杂溶液；或者，将上述蛛丝丝心蛋白与作为溶解促进剂的无机盐一起添加到这些溶剂中，进行溶解而制作混杂溶液。接着，使用该混杂溶液，利用湿式纺丝、干式纺丝、干湿式纺丝等公知的纺丝方法进行纺丝，能够得到蛋白质原料。需要说明的是，可以在上述混杂溶液中添加稳定剂使其溶解，另外，也可以在溶解有稳定剂的溶液中混合上述蛛丝丝心蛋白而制成混杂溶液。作为在此使用的混杂溶液的溶剂，使用也能够溶解稳定剂的溶剂。也可以将溶解有稳定剂的溶液与溶解有上述蛛丝丝心蛋白的溶液的混合溶液作为混杂溶液。

此外，也可以使上述蛛丝丝心蛋白分散在溶解有稳定剂的溶液中而得到分散体，使用从该分散体中除去溶剂而得到的干燥物来制作混杂溶液。

实施例

以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。

1.蛛丝蛋白(蛛丝丝心蛋白)的制造

(编码蛛丝蛋白的基因的合成和表达载体的构建)

基于来源于金纺蜘蛛(nephilaclavipes)的丝心蛋白(genbank登记号：p46804.1、gi：1174415)的碱基序列和氨基酸序列，设计出具有序列号1所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白(以下也称为“prt410”)。

序列号1所表示的氨基酸序列具有以提高生产率为目的对来源于金纺蜘蛛的丝心蛋白的氨基酸序列实施氨基酸残基的置换、插入和缺失而得到的氨基酸序列，并进一步在n末端附加有序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)。

接着，合成编码prt410的核酸。该核酸中，在5’末端附加有ndei位点、在终止密码子下游附加有ecori位点。将该核酸克隆至克隆载体(puc118)中。然后，利用ndei和ecori对该核酸进行限制酶处理并将其切出后，重组到蛋白质表达载体pet-22b(+)中得到表达载体。

利用包含编码具有序列号1所表示的氨基酸序列的蛋白质的核酸的pet22b(+)表达载体对大肠杆菌blr(de3)进行转化。将该转化大肠杆菌在含有氨苄青霉素的2ml的lb培养基中培养15小时。将该培养液添加到含有氨苄青霉素的100ml的种子培养用培养基(表1)中，使od600达到0.005。将培养液温度保持于30℃，进行烧瓶培养直至od600达到5为止(约15小时)，得到种子培养液。

[表1]

将该种子培养液添加到添加有500ml的生产培养基(下述表2)的发酵罐中，使od600达到0.05。将培养液温度保持于37℃，在ph6.9下控制为恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。

[表2]

在生产培养基中的葡萄糖被完全消耗后，立即以1ml/分钟的速度添加补料液(葡萄糖455g/1l、酵母提取物120g/1l)。将培养液温度保持于37℃，在ph6.9下控制为恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％，进行20小时培养。然后，向培养液中添加1m的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)以使终浓度达到1mm，诱导表达目标蛋白质。在添加iptg后经过20小时的时刻，离心分离培养液，回收菌体。使用由添加iptg前和添加iptg后的培养液制备的菌体进行sds-page，根据依赖于iptg添加的目标蛋白质大小的条带的出现，确认到目标蛋白质的表达。

(蛋白质的纯化)

将添加iptg后2小时后回收的菌体用20mmtris-hcl缓冲液(ph7.4)进行清洗。使清洗后的菌体悬浮在包含约1mm的pmsf的20mmtris-hcl缓冲液(ph7.4)中，利用高压均质器(geanirosoavi公司)将细胞破碎。将破碎的细胞离心分离，得到沉淀物。利用20mmtris-hcl缓冲液(ph7.4)清洗所得到的沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后的沉淀物以达到100mg/ml的浓度的方式悬浮在8m胍缓冲液(8m胍盐酸盐、10mm磷酸二氢钠、20mmnacl、1mmtris-hcl、ph7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离来回收透析后得到的白色凝集蛋白质，利用冷冻干燥机除去水分，回收冷冻干燥粉末。

所得到的冷冻干燥粉末中的目标蛋白质的纯化度通过使用totallab(nonlineardynamicsltd.)对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果进行图像分析来确认。其结果，任一蛋白质的纯化度均为约85％。

2-1.蛋白质组合物1(粉末)的制造

将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末200mg分别导入至样品瓶中。使下述表3所示的稳定剂以0.3mg/ml的浓度溶解在溶剂(使丙酮/甲醇的体积比为1/1的混合溶剂)中，将该稳定剂溶液2ml分别导入至样品瓶中(稳定剂量：0.6mg)。然后，将样品瓶加封并在室温下进行16小时搅拌后，进行自然干燥，使溶剂挥发，由此制备含有稳定剂的粉末(粉末状蛋白质组合物)(相对于干燥物总量的稳定剂含量：0.3质量％)。

未添加稳定剂，除此以外与上述同样地制备蛋白质粉末，将其作为对照。

[表3]

热稳定性的评价如下进行。在容纳试样的腔室中设置上述含有稳定剂的粉末(粉末状蛋白质组合物)，将该腔室安装到装置中。然后，使干燥空气以100ml/分钟的流速流通，保持于200℃，利用化学发光分析仪(东北电子产业株式会社制cla-id2-hs)检测化学发光强度的经时变化。将未添加稳定剂的蛋白质粉末的化学发光强度达到最大值为止的时间设为t0、将含有稳定剂的粉末(粉末状蛋白质组合物)的化学发光强度达到最大值为止的时间设为t1，利用下式算出extentionoftimeatimax。

(t1-t0)/t0×100[％]

extentionoftimeatimax[％]是指化学发光强度达到最大值为止的延迟时间，数值大的表示热稳定性高。关于表3的稳定剂，将结果示于下述表4中。

[表4]

2-2.蛋白质组合物1(粉末)的制造

将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)200mg导入至样品瓶中。使用3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯作为稳定剂，将稳定剂的含量设定为0.5质量％，除此以外与上述2-1.同样地制备含有稳定剂的粉末(粉末状蛋白质组合物)(相对于干燥物总量的稳定剂含量：0.5质量％)。

作为对照，未添加稳定剂，除此以外与上述同样地制备蛋白质粉末。

与上述2-1.同样地进行热稳定性的评价。算出的extentionoftimeatimax[％]的值为35％。

3-1.蛋白质组合物2(膜)的制造

将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)0.56g分别导入至样品瓶中。使氯化钙2.22g溶解在蒸馏水8.4ml、乙醇6.7ml的混合溶液中，制作人造蛛丝蛋白粉末的溶解溶剂后，将该溶解溶剂5g分别导入至样品瓶中。使下述表5所示的稳定剂以1.4质量％的浓度溶解在乙醇中。将该稳定剂溶液100μl分别导入至样品瓶中(稳定剂量：1.12mg)，在65℃下进行6小时搅拌，由此制备混杂溶液。

将所制备的混杂溶液0.63g浇注到聚苯乙烯(ps)制的培养皿中，在60℃、550hpa的状态下静置7天，由此进行干燥。干燥后，将各培养皿在丙酮、甲醇混合溶液(比率7:3)中浸渍30分钟。然后，从培养皿上剥取膜，在甲醇溶液中浸渍30分钟后进行自然干燥，由此制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.2质量％)。

[表5]

热稳定性的评价如下进行。在容纳试样的腔室中设置上述膜，将该腔室安装到装置中。然后，使干燥空气以100ml/分钟的流速流通，保持于200℃，利用化学发光分析仪(东北电子产业株式会社制cla-id2-hs)检测化学发光强度的经时变化。将未添加稳定剂的膜的化学发光强度达到最大值为止的时间设为t0、将含有稳定剂的膜的化学发光强度达到最大值为止的时间设为t1，除此以外利用与上述2-1.同样的方法算出extentionoftimeatimax[％]。将其结果示于下述表6中。

[表6]

3-2.蛋白质组合物2(膜)的制造

在表5所示的稳定剂中，按照下述表7所示的组合使用稳定剂。使两种稳定剂分别以1.4质量％的浓度溶解在乙醇中，除此以外与上述3-1.同样地制备混杂溶液(稳定剂量：2.24mg)，制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

为了进行比较，单独使用3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯作为稳定剂，以2.8质量％的浓度溶解在乙醇中，除此以外与上述3-1.同样地制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

[表7]

热稳定性的评价按照与上述3-1.同样的过程进行，算出extentionoftimeatimax[％]。将其结果示于下述表8中。

[表8]

如表8所示，与单独使用3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜相比，使用3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯和2,2’-亚甲基双(4,6-二叔丁基苯基)2-乙基己基亚磷酸酯这两种稳定剂制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜显示出更高的热稳定性。

3-3.蛋白质组合物2(膜)的制造

按照下述表9所示的组合使用稳定剂，除此以外与上述3-2.同样地制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

为了进行比较，单独使用6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)作为稳定剂，除此以外与上述3-2.同样地制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

[表9]

热稳定性的评价按照与上述3-1.同样的过程进行，算出extentionoftimeatimax[％]。将其结果示于下述表10中。

[表10]

如表10所示，与单独使用6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜相比，使用6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)和硫代双[2-(1,1-二甲基乙基)-5-甲基-4,1-亚苯基]-双[3-(十二烷基硫代)丙酸酯]这两种稳定剂制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜显示出更高的热稳定性。

3-4.蛋白质组合物2(膜)的制造

按照下述表11所示的组合使用稳定剂，除此以外与上述3-2.同样地制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

为了进行比较，单独使用n,n’-己烷-1,6-二基双(3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺))作为稳定剂，除此以外与上述3-2.同样地制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

[表11]

热稳定性的评价按照与上述3-1.同样的过程进行，算出extentionoftimeatimax[％]。将其结果示于下述表12中。

[表12]

如表12所示，与单独使用n,n’-己烷-1,6-二基双(3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺))制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜相比，使用n,n’-己烷-1,6-二基双(3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酰胺))和2,2’-亚甲基双(4,6-二叔丁基苯基)2-乙基己基亚磷酸酯这两种稳定剂制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜显示出更高的热稳定性。

3-5.蛋白质组合物2(膜)的制造

按照下述表13所示的组合使用稳定剂，除此以外与上述3-2.同样地制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

为了进行比较，单独使用聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]])作为稳定剂，除此以外与上述3-2.同样地制作厚度120μm的含有稳定剂的人造蛛丝膜(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.4质量％)。

[表13]

热稳定性的评价按照与上述3-1.同样的过程进行，算出extentionoftimeatimax[％]。将其结果示于下述表14中。

[表14]

如表14所示，与单独使用聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]])制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜相比，使用聚[[6-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]-1,3,5-三嗪-2,4-二基][(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]-1,6-己烷二基[(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)亚氨基]])与3,9-双(2,6-二叔丁基-4-甲基苯氧基)-2,4,8,10-四氧杂-3,9-二磷杂螺[5.5]十一烷、2,2’-亚甲基双(4,6-二叔丁基苯基)2-乙基己基亚磷酸酯或硫代双[2-(1,1-二甲基乙基)-5-甲基-4,1-亚苯基]双[3-(十二烷基硫代)丙酸酯]中的任意一种这两种稳定剂制作的含有稳定剂的人造蛛丝膜显示出更高的热稳定性。

4-1.蛋白质组合物1(模压成形体)的制造

将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)9.98g导入至样品瓶中。使作为稳定剂的3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯以1mg/ml的浓度溶解在乙醇中，将该稳定剂溶液导入至20ml样品瓶中(稳定剂量：20mg)。然后，将样品瓶加封并在室温下进行60分钟超声波搅拌。进一步搅拌60小时后，在40℃下进行4小时减压干燥，使溶剂挥发，由此制备含有稳定剂的粉末(稳定剂相对于干燥物总量的含量：0.2质量％)。

将含有稳定剂的粉末用磨机(iwatani公司制、ifm-80)粉碎并对粒径进行调节后，称取粒径调节后的含有稳定剂的粉末(以下称为“蛋白质组合物”)1.35g，将该蛋白质组合物导入至图1所示的加压成形机10的模具2(其为圆柱形的模具，具有截面为35mm×15mm的长方形贯通孔)的贯通孔内。此时，以厚度均等的方式加入蛋白质组合物。导入全部蛋白质组合物后，开始模具2的加热，同时使用手动压力机(npa系统株式会社制造、nt-100h-v09)，通过将上侧销4和下侧销6向贯通孔内插入来进行蛋白质组合物的加压。此时，蛋白质组合物的加压条件控制为40kn。在蛋白质组合物的温度达到200℃时中止加热，进行自然冷却，在蛋白质组合物的温度达到50℃时取出，进行去毛刺后，得到35mm×15mm×2mm的长方体形状的含有稳定剂的模压成形体(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.2质量％)。

另外，将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)9.95g导入至样品瓶中。使作为稳定剂的3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯以2.5mg/ml的浓度溶解在乙醇中，将该稳定剂溶液导入至20ml样品瓶中(稳定剂量：50mg)。除此以外按照与上述同样的过程得到35mm×15mm×2mm的长方体形状的含有稳定剂的模压成形体(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.5质量％)。

为了进行比较，将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)10g导入至样品瓶中，然后导入乙醇20ml(未添加稳定剂)。除此以外按照与上述同样的过程得到35mm×15mm×2mm的长方体形状的模压成形体。

关于热稳定性，进行弯曲试验来进行成形体的强度评价。即，将所得到的模压成形体在恒温恒湿槽(espec公司制造、lhl-113)中在20℃/65％rh的条件下静置1天后，在autograph(电子万能试验机)(岛津制作所株式会社制造、ag-xplus)中使用笼夹具进行三点弯曲试验。所使用的测力传感器为50kn。此时，将三点弯曲的支点间距离固定为27mm，使测定速度为1mm/分钟。另外，利用千分尺测定模压成形体的尺寸，设置于夹具上进行试验。将其结果示于下述表15中。

[表15]

4-2.蛋白质组合物1(模压成形体)的制造

称取与上述4-1.同样制备的含有稳定剂的粉末(以下称为“蛋白质组合物”)1.35g，导入至模具2(图1)的贯通孔内(稳定剂相对于干燥物总量的含量：0.2质量％)。对于蛋白质组合物的加热，在蛋白质组合物的温度达到130℃时保持5分钟，然后中止加热，除此以外按照与上述4-1.同样的过程得到含有稳定剂的模压成形体(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.2质量％)。

为了进行比较，将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末10g(prt410)导入至样品瓶中，然后导入乙醇20ml。除此以外与上述4-1.同样地得到模压成形体(未添加稳定剂)。

关于热稳定性，与上述4-1.同样地进行弯曲试验来进行成形体的强度评价。将其结果示于下述表16中。

[表16]

如表16所示，与在未添加稳定剂的情况下制作的模压成形体相比，添加3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯而制作的含有稳定剂的模压成形体显示出更高的热稳定性。

4-3.蛋白质组合物1(模压成形体)的制造

使作为稳定剂的6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)以1mg/ml的浓度溶解在乙醇中，将该稳定剂溶液导入至30ml样品瓶中(稳定剂量：30mg)。将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)9.97g导入至样品瓶中。将样品瓶加封，在室温下使用市售的磁力搅拌器进行一晩搅拌。将分散液转移至无盖的容器中，在通风橱内静置3天，使乙醇挥发除去，然后进一步在35℃下进行数小时减压干燥，制备含有稳定剂的粉末(粉末状蛋白质组合物)(以下称为“蛋白质组合物”)。称取蛋白质组合物1.35g，导入至模具2(图1)的贯通孔内。对于蛋白质组合物的加热，在蛋白质组合物的温度达到190℃时保持5分钟，然后中止加热。除此以外与上述4-1.同样地得到35mm×15mm×2mm的长方体形状的含有稳定剂的模压成形体(相对于干燥物总量的稳定剂含有率：0.3质量％)。

为了进行比较，将上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)10g导入至样品瓶中，然后导入乙醇30ml。除此以外与上述4-1.同样地得到35mm×15mm×2mm的长方体形状的模压成形体(未添加稳定剂)。

关于热稳定性，与上述4-1.同样地进行弯曲试验来进行成形体的强度评价。将其结果示于下述表17中。

[表17]

如表17所示，与在未添加稳定剂的情况下制作的模压成形体相比，添加6,6’-二叔丁基-4,4’-亚丁基二(间甲酚)而制作的含有稳定剂的模压成形体显示出更高的热稳定性。

5.蛋白质组合物2(纤维)的制造

<混杂溶液的制备>

作为溶剂，制备以4质量％的浓度溶解有licl的二甲亚砜(licl/dmso)。称量上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)的干燥粉末3.5g，导入至样品瓶中。添加licl/dmso溶剂使浓度达到24质量％，使用机械搅拌器进行搅拌的同时，加热至90℃使其溶解，自然冷却至60℃，制备蛋白质溶液。

在另外的样品瓶中导入2-丙醇，添加作为稳定剂的3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯使其溶解，制备稳定剂溶液。将所制备的稳定剂溶液添加至上述蛋白质溶液中。使用机械搅拌器对混合溶液进行搅拌的同时，加热至90℃使其溶解，制备含有稳定剂的混杂溶液。含有稳定剂的混杂溶液的稳定剂含有率分别设定为0.2质量％、0.5质量％、1.0质量％、4.0质量％。

为了进行比较，制备不含稳定剂的混杂溶液。称量上述纯化工序中得到的人造蛛丝蛋白粉末(prt410)的干燥粉末3.5g，导入至样品瓶中。添加上述licl/dmso溶剂使浓度达到24质量％，与上述同样地制备混杂溶液(未添加稳定剂)。

<纺丝>

使用公知的纺丝装置在下述条件下对所得到的含有稳定剂的混杂溶液进行干湿式纺丝，将所形成的纤维干燥后进行卷取，由此制作蛋白质组合物2(纤维)。干湿式纺丝的条件如下所述。

凝固液：甲醇

总拉伸倍率：5倍

干燥温度：60℃

<热稳定性的评价>

热稳定性的评价如下进行。在容纳试样的腔室中设置上述含有稳定剂的蛋白质纤维，将该腔室安装到装置中。然后，使干燥空气以100ml/分钟的流速流通，保持于190℃，利用化学发光分析仪(东北电子产业株式会社制cla-id2-hs)检测化学发光强度的经时变化。将未添加稳定剂的蛋白质纤维的化学发光强度达到最大值为止的时间设为t0、将含有稳定剂的蛋白质纤维的化学发光强度达到最大值为止的时间设为t1，利用下式算出extentionoftimeatimax。

(t1-t0)/t0×100[％]

将其结果示于下述表18中。

[表18]

如表18所示，使用稳定剂含有率为0.5质量％的含有稳定剂的混杂溶液制作的含有稳定剂的蛋白质纤维显示出最高的热稳定性。

标号说明

2…模具、4…上侧销、6…下侧销、8a…加热加压前的蛋白质组合物、8b…加热加压后的蛋白质组合物、10…加压成形机。

序列表

<110>丝芭博株式会社（spiberinc.）

小岛冲压工业株式会社（kojimaindustriescorporation）

<120>蛋白质组合物、其制造方法和热稳定性提高方法（proteinformulation,manufacturingmethodthereofandmethodforimprovingaheatresistance）

<130>fp17-0882-00

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

<220>

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