本发明涉及一种基于荧光共振能量转移机理的检测亚硫酸氢根的比率荧光探针及其在检测含亚硫酸氢根样品中的应用；属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术：
丹磺酰荧光团本身具有较大的摩尔消光系数和量子产率，可用于化学传感器以及标记生物分子。近几年利用比率荧光法检测亚硫酸氢根，并在活体细胞中成像得到不断发展。
亚硫酸盐是广泛使用的食品添加剂、防腐剂和漂白剂，是十分有效的抗菌剂。人体自身在代谢过程中也会产生亚硫酸离子，但是高浓度的亚硫酸盐能引起人腹泻、过敏、血压降低、哮喘等，WHO规定每人每日亚硫酸盐的允许摄入量为0-0.7mg/kg(以二氧化硫计)。亚硫酸盐对生理病理等的生物学功能有待详细研究，因此，亟待建立在生物和实际样品中方便快捷实时检测亚硫酸盐的有效方法。
目前已知的检测亚硫酸盐的方法包括色谱法、传感器法、电化学法、毛细管电泳和酶技术联用等，但这些方法具有很大局限性，如仪器昂贵、样品处理复杂、费时等。已公开的专利【CN102072901B】、【CN103743726A】可以不使用大型仪器检测食品中的亚硫酸盐，但是只能用于液体样的检测。而新兴的荧光法具有操作方便，灵敏度高等特点。已授权的专利【CN102924530B】、【CN102659677B】展示了特异性检测亚硫酸盐的探针，但是分别存在着单信号检测和无法细胞成像的缺点。基于此，开发具有细胞成像能力，而且可以比率检测、裸眼识别的亚硫酸氢根荧光探针成为目前亟待解决的关键技术。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于荧光共振能量转移机理的检测亚硫酸氢根的比率荧光探针及其在检测含亚硫酸氢根样品中的应用。
本发明所述检测亚硫酸氢根的比率荧光探针是由丹磺酰荧光团作为供体，(E)-2-(3-氰基-4-(4-(二甲氨基)苯乙烯)-5,5-二甲基呋喃-2(5H)-亚基)丙二腈荧光团作为受体，通过哌嗪联接构筑成基于荧光共振能量转移(FRET)机理的检测亚硫酸氢根的比率荧光探针，该比率荧光探针化学结构式如式(I)所示：
上述检测亚硫酸氢根的比率荧光探针的制备方法是：将4-(哌嗪-1-基)苯甲醛与2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚基)丙二腈反应得到的中间体，再与商品化的丹磺酰氯反应获得。
本发明所述检测亚硫酸氢根的比率荧光探针在检测含亚硫酸氢根样品中的应用。
其中：所述含亚硫酸氢根样品优选是生物细胞，或含亚硫酸氢根的溶液。
进一步的，所述生物细胞优选是HepG2细胞；所述含亚硫酸氢根的溶液优选是亚硫酸氢根的水溶液。
本发明所述的检测亚硫酸氢根的比率荧光探针本身在丹磺酰荧光团(能量供体)的激发波长下，供体荧光很弱，但能量受体荧光团的荧光很强，表明发生了有效的荧光共振能量转移；当其与亚硫酸氢根在水溶液中发生加成反应后，阻断共轭体系，从而阻断了荧光共振能量转移，受体荧光团的荧光强度逐渐下降，而供体荧光团的荧光逐渐增强。随着亚硫酸氢根浓度变化，两个波长的荧光强度一升一降，因此，亚硫酸氢根浓度与两个发射波长的荧光强度比呈现很好的线性关系，从而实现以比率信号检测亚硫酸氢根，如图1所示。
实验证实：HepG2细胞用含5μM本发明探针(HTF)的培养液孵育1小时，分别进行(有或无)内源性亚硫酸氢根的成像，结果显示：本发明的探针能够有效检测细胞内亚硫酸氢根。如图2所示。
本发明所述检测亚硫酸氢根的比率荧光探针在细胞内脂滴定位成像中的应用。
其中：所述细胞优选是3T3-L1细胞。
实验证实：本发明所述检测亚硫酸氢根的比率荧光探针的另一个显著特征在于该探针能够靶向脂滴，如图3所示。
本发明提供的检测亚硫酸氢根的比率荧光探针能选择性地与亚硫酸氢根作用，通过荧光共振能量转移原理，两个波长的荧光强度比与亚硫酸氢根浓度呈现线性关系，具有荧光比率响应效应，可以实现通过荧光光度法进行分析。
本发明提供的检测亚硫酸氢根的比率荧光探针不仅可以比率检测亚硫酸氢根离子，实现细胞内的比率成像，而且能靶向脂滴。为生物医学领域相关检测或靶向定位提供了有力的工具，有望在生物科学研究中发挥作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为荧光滴定图。
其中：探针浓度为5μM，HSO3-(0-7equiv.)，PBS:EtOH＝5:5缓冲溶液(pH＝6.5)(λex＝390nm)。插图是本发明的探针在有(无)HSO3-(20equiv.)条件下的紫外光照片。
图2为本发明的探针在HepG2细胞内荧光显微成像图。
其中：
(A)Ctr组是在37℃条件下，HepG2细胞在加入本发明的探针(5.0μM)的细胞培养液中培养1小时；GSH组为HepG2细胞在加入谷胱甘肽(250μM)孵育1小时后用本发明的探针(5.0μM)培养1小时；GSH/Na2S2O3组为GSH(250μM)和Na2S2O3(250μM)孵育1小时后用本发明的探针(5.0μM)培养1小时；第四列为用TNBS(10mM)孵育20分钟后再用GSH(250μM)和Na2S2O3(250μM)孵育1小时，然后用本发明的探针(5.0μM)培养1小时。
(B)荧光强度的相对比值(绿/红)。λex＝405nm；绿色通道(450–621nm)；红色通道(621–700nm)(37℃；**,P<0.01；n＝3.)。
图3本发明的探针在细胞内的定位图。
其中：3T3-L1细胞用本发明的探针(10μM)孵育4小时，接着用中性脂质染料HCS LipidTOXTM(Invitrogen,H34477,用DMEM-H溶液稀释200倍)孵育30分钟。
(a)：本发明探针的荧光成像(λex＝405nm,λem＝621-700nm)；(b)：中性脂质染料的荧光成像(λex＝639nm,λem＝640-700nm)；(c)：(a)与(b)的叠加；(d)：3T3-L1细胞的透射成像；(e)共定位系数：0.90。
具体实施方式
实施例1本发明所述检测亚硫酸氢根的比率荧光探针的制备
将(E)-2-(3-氰基-5,5-二甲基-4-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯基)呋喃-2(5H)-亚基)丙二腈(0.148g，0.400mmol)与丹磺酰氯(0.108g，0.400mmol)在干燥的二氯甲烷(15mL)和三乙胺(0.5mL)中室温搅拌1.5小时，用硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝5/1)即可得到本发明的探针(65mg,yield 26.8％)。
熔点:275-277℃；
核磁共振氢谱测定：1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ＝1.74(s,6H),2.83(s,6H),3.22(t,J＝5.7Hz,4H),3.51(t,J＝5.6Hz,4H),6.94(d,J＝15.9Hz,1H),6.98(d,J＝9Hz,2H),7.27(d,J＝6.9Hz,1H),7.60-7.71(m,2H),7.74(d,J＝9Hz,2H),7.86(d,J＝15.9Hz,1H),8.17(dd,J＝1.2and 7.5Hz,1H),8.34(d,J＝8.7Hz,1H),8.54(d,J＝8.4Hz,1H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR(75MHz,DMSO-d6):25.91,45.46,45.51,46.66,95.01,99.08,110.84,112.02,112.78,113.61,114.76,115.81,119.34,124.17,124.55,128.77,129.71,130.18,130.67,130.97,132.68,132.77,148.92,151.94,153.50,176.10,177.73。
高分辨质谱：HR-MS:m/z[M+H]+calcd for[C34H32N6O3S+H]+:605.2329,found 605.2373。
其反应过程如下式所示：
实施例2
以EtOH-PBS缓冲液(5:5,v/v,10mM PBS,pH6.5)分别配制系列10mL本发明的探针溶液，使探针浓度为5μM，其中EtOH-PBS为PBS:EtOH＝5:5缓冲溶液(pH＝6.5)。
用微量注射器分别定量加入0.2至10当量的亚硫酸氢钠的水溶液，作用12小时后进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试(λex＝390nm)。
结果显示：本发明的探针在两个发射波长下的荧光强度比(I545/I637)与亚硫酸氢钠的浓度呈现线性关系，见图1。
实施例3
细胞内荧光成像测试：
Ctr组是在37℃条件下，HepG2细胞在加入本发明的探针(5.0μM)的细胞培养液中培养1小时；GSH组为HepG2细胞在加入谷胱甘肽(250μM)孵育1小时后用本发明的探针(5.0μM)培养1小时；GSH/Na2S2O3组为GSH(250μM)和Na2S2O3(250μM)孵育1小时后用本发明的探针(5.0μM)培养1小时；第四列为用TNBS(10mM)孵育20分钟后再用GSH(250μM)和Na2S2O3(250μM)孵育1小时，然后用本发明的探针(5.0μM)培养1小时。细胞成像见图2A。
结果表明：本发明的探针能够对细胞内源性亚硫酸氢根进行检测，见图2B。
实施例4
脂滴定位测试：
3T3-L1细胞用含10μM本发明探针的培养液孵育4小时，接着用中性脂质染料HCS LipidTOXTM(Invitrogen,H34477,用DMEM-H溶液稀释200倍)孵育30分钟。
结果显示本发明的探针能够靶向脂滴，共定位系数为0.9，见图3。