一种快速检测人类CYP2C19基因多态性的方法与流程

本发明涉及一种与药物代谢相关酶的基因的快速检测方法，具体涉及人类cyp2c19基因多态性检测的方法。

背景技术：

细胞色素p450酶(cytochromep450，cyp)是一类以血红素为辅基的b族细胞色素的超家族蛋白酶，其中cyp2c19酶是细胞色素p450酶系的重要一员。cyp2c19酶基因具有高度的遗传多态性，可以影响到许多临床应用药物的代谢速率。已报道的与cyp2c19代谢相关的药物多达24种，包括了质子泵抑制剂、抗抑郁药、抗癫痫药和抗肿瘤药等重要药物，根据cyp2c19酶基因多态性的检测结果，可以进一步合理地选择药物剂量，从而提高疗效，并降低毒副反应的发生概率。

至今已发现的cyp2c19弱代谢突变基因至少有14种，等位基因有18种，为常染色体隐性遗传，它的基因突变类型主要包括了cyp2c19*2、cyp2c19*3和cyp2c19*17，发生率分别为30％，5％和4％，其中cyp2c19*2等位基因在第681位处碱基发生g/a突变，cyp2c19*3等位基因在第636位处碱基发生g/a突变，cyp2c19*17等位基因在第-806位处碱基发生c/t突变。由遗传决定的cyp2c19底物的代谢多态性在人群中有四种表型，即超快代谢型(um)、快代谢型(em)、中代谢型(im)和弱代谢型(pm)。超快代谢型包括两种基因型，为(681gg，636gg，-806tt)和(681gg，636gg，-806ct)；快代谢型为(681gg，636gg，-806cc)；中代谢型包括两种基因型，为(681ga，636gg，-806cc)和(681gg，636ag，-806cc)；弱代谢型包括五种基因型，为(681aa，636gg，-806cc)、(681ag，636ag，-806cc)、(681gg，636aa，-806cc)、(681ag，636aa，-806cc)和(681aa，636ag，-806cc)。

通常，用于cyp2c19基因多态性检测的dna样品来自于人的体液(如静脉血)和组织(如肝组织、胃黏膜等)：采外周静脉血(edta抗凝)，提取基因组dna；或胃黏膜标本经研磨后，对研磨液进行离心，弃上清后进行基因组dna的提取。用测序法对提取的基因组dna进行检测，可用以判定cyp2c19基因型的多态性。上述dna样品来源(体液或组织)均需要去医院才能采集，甚至要通过有创手段才能获取。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供一种快速检测人类cyp2c19基因多态性的方法。本发明所要解决的技术问题是克服样品采集的局限，使采集收样过程更为简单、快速，进而方便后续分子生物学检测的开展。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：利用口香糖来黏附人口腔内脱落的上皮细胞，口香糖胶基中所含的成膜物质具有粘性，具体的，被检测人需在未刷牙未饮食摄水的清晨第一时间，咀嚼口香糖5-10分钟。进一步的，从口香糖咀嚼物中提取基因组dna，所述dna提取方法包括以下步骤：

(1)将口香糖咀嚼物，置于灭菌后的研钵中，加入适量液氮，快速进行研磨，至物质变为粉末状后，停止研磨；

(2)用无菌小勺将粉末状物质，置于含500μl裂解提取液的ep管中，充分震荡混匀；

(3)95℃金属浴或水浴15分钟；

(4)在4℃环境内静置30分钟以上；

(5)4℃，12000rpm离心5分钟后取上清，4℃或-20℃贮存备用。

然后通过pcr-dna测序相结合的方法，判断被检测人cyp2c19基因多态性。

本发明取材方便、不受场所限制，通过咀嚼一定时长的口香糖即可在任何地点完成取材过程；送检也相当便捷，将咀嚼完毕的口香糖放入无菌冻存管中就能轻松运输送检；且样品检测成功率高，可使cyp2c19基因多态性检测进一步推广，从而指导药物的合理使用。

附图说明

图1是cyp2c19基因特异pcr电泳检测条带；其中m为marker；泳道1、2、3对应样本1；泳道4、5、6对应样本2；泳道7、8、9对应样本3；泳道10、11、12对应样本4。泳道1、4、7、10对应基因组dnacyp2c19*2特异性pcr，条带大小为381bp；泳道2、5、8、11对应基因组dnacyp2c19*3特异性pcr，条带大小为375bp；泳道3、6、9、12对应基因组dnacyp2c19*17特异性pcr，条带大小为497bp。

图2是样本1号的cyp2c19基因测序峰图。

图3是样本2号的cyp2c19基因测序峰图。

图4是样本3号的cyp2c19基因测序峰图。

图5是样本4号的cyp2c19基因测序峰图。

图2-5中a为cyp2c19681位点的测序峰图；b为cyp2c19636位点的测序峰图；c为cyp2c19-806位点的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

本发明的实施例1：

本实例中选取4名被测试人，各自在未刷牙未饮食摄水前咀嚼一块1.1cm×4.4cm的口香糖10分钟。咀嚼完毕的口香糖放入无菌冻存管中，分别标记为样本1、样本2、样本3和样本4。

提取样本的基因组dna：

(1)将口香糖咀嚼物，置于灭菌后的研钵中，加入适量液氮，快速进行研磨，至物质变为粉末状后，停止研磨；

(2)用无菌小勺将粉末状物质，置于含500μl裂解提取液的ep管中，充分震荡混匀；

(3)95℃水浴15分钟；

(4)在4℃环境内静置30分钟；

(5)4℃，12000rpm离心5分钟后取上清，4℃备用。

以基因组dna为模板进行cyp2c19基因特异pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后结果显示条带清晰特异，扩增及测序成功率为100％。根据测序结果可知，样本1对应的基因型为(681gg，636gg，-806ct)，属于超快代谢型；样本2对应的基因型为(681gg，636gg，-806cc)，属于快代谢型；样本3对应的基因型为(681ag，636aa，-806cc)，属于慢代谢型；样本4对应的基因型为(681ga，636gg，-806cc)，属于中代谢型。

上述的具体实施方式只是示例性的，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。凡根据本发明精神实质所作的各种改动或修改，均落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：

技术总结
本发明涉及一种快速检测人类CYP2C19基因多态性的方法，所述方法是利用口香糖来黏附人口腔内脱落的上皮细胞，继而从口香糖咀嚼物中提取基因组DNA。DNA的提取包括以下步骤：将口香糖咀嚼物快速进行研磨；置于含裂解提取液的EP管中充分震荡混匀；金属浴或水浴；静置、离心后取上清；通过PCR‑DNA测序相结合的方法，判断被检测人CYP2C19基因多态性。本发明取材方便、送检便捷、且样品检测成功率高。

技术研发人员：杨比特
受保护的技术使用者：致远医学云检验(深圳)有限公司
技术研发日：2018.03.28
技术公布日：2019.10.11