一种快速检测人类CYP2C19基因多态性的方法与流程

文档序号:18872917发布日期:2019-10-14 19:57阅读:2269来源:国知局
一种快速检测人类CYP2C19基因多态性的方法与流程

本发明涉及一种与药物代谢相关酶的基因的快速检测方法,具体涉及人类cyp2c19基因多态性检测的方法。



背景技术:

细胞色素p450酶(cytochromep450,cyp)是一类以血红素为辅基的b族细胞色素的超家族蛋白酶,其中cyp2c19酶是细胞色素p450酶系的重要一员。cyp2c19酶基因具有高度的遗传多态性,可以影响到许多临床应用药物的代谢速率。已报道的与cyp2c19代谢相关的药物多达24种,包括了质子泵抑制剂、抗抑郁药、抗癫痫药和抗肿瘤药等重要药物,根据cyp2c19酶基因多态性的检测结果,可以进一步合理地选择药物剂量,从而提高疗效,并降低毒副反应的发生概率。

至今已发现的cyp2c19弱代谢突变基因至少有14种,等位基因有18种,为常染色体隐性遗传,它的基因突变类型主要包括了cyp2c19*2、cyp2c19*3和cyp2c19*17,发生率分别为30%,5%和4%,其中cyp2c19*2等位基因在第681位处碱基发生g/a突变,cyp2c19*3等位基因在第636位处碱基发生g/a突变,cyp2c19*17等位基因在第-806位处碱基发生c/t突变。由遗传决定的cyp2c19底物的代谢多态性在人群中有四种表型,即超快代谢型(um)、快代谢型(em)、中代谢型(im)和弱代谢型(pm)。超快代谢型包括两种基因型,为(681gg,636gg,-806tt)和(681gg,636gg,-806ct);快代谢型为(681gg,636gg,-806cc);中代谢型包括两种基因型,为(681ga,636gg,-806cc)和(681gg,636ag,-806cc);弱代谢型包括五种基因型,为(681aa,636gg,-806cc)、(681ag,636ag,-806cc)、(681gg,636aa,-806cc)、(681ag,636aa,-806cc)和(681aa,636ag,-806cc)。

通常,用于cyp2c19基因多态性检测的dna样品来自于人的体液(如静脉血)和组织(如肝组织、胃黏膜等):采外周静脉血(edta抗凝),提取基因组dna;或胃黏膜标本经研磨后,对研磨液进行离心,弃上清后进行基因组dna的提取。用测序法对提取的基因组dna进行检测,可用以判定cyp2c19基因型的多态性。上述dna样品来源(体液或组织)均需要去医院才能采集,甚至要通过有创手段才能获取。



技术实现要素:

本发明的主要目的是提供一种快速检测人类cyp2c19基因多态性的方法。本发明所要解决的技术问题是克服样品采集的局限,使采集收样过程更为简单、快速,进而方便后续分子生物学检测的开展。

为了达到上述目的,本发明的技术方案是:利用口香糖来黏附人口腔内脱落的上皮细胞,口香糖胶基中所含的成膜物质具有粘性,具体的,被检测人需在未刷牙未饮食摄水的清晨第一时间,咀嚼口香糖5-10分钟。进一步的,从口香糖咀嚼物中提取基因组dna,所述dna提取方法包括以下步骤:

(1)将口香糖咀嚼物,置于灭菌后的研钵中,加入适量液氮,快速进行研磨,至物质变为粉末状后,停止研磨;

(2)用无菌小勺将粉末状物质,置于含500μl裂解提取液的ep管中,充分震荡混匀;

(3)95℃金属浴或水浴15分钟;

(4)在4℃环境内静置30分钟以上;

(5)4℃,12000rpm离心5分钟后取上清,4℃或-20℃贮存备用。

然后通过pcr-dna测序相结合的方法,判断被检测人cyp2c19基因多态性。

本发明取材方便、不受场所限制,通过咀嚼一定时长的口香糖即可在任何地点完成取材过程;送检也相当便捷,将咀嚼完毕的口香糖放入无菌冻存管中就能轻松运输送检;且样品检测成功率高,可使cyp2c19基因多态性检测进一步推广,从而指导药物的合理使用。

附图说明

图1是cyp2c19基因特异pcr电泳检测条带;其中m为marker;泳道1、2、3对应样本1;泳道4、5、6对应样本2;泳道7、8、9对应样本3;泳道10、11、12对应样本4。泳道1、4、7、10对应基因组dnacyp2c19*2特异性pcr,条带大小为381bp;泳道2、5、8、11对应基因组dnacyp2c19*3特异性pcr,条带大小为375bp;泳道3、6、9、12对应基因组dnacyp2c19*17特异性pcr,条带大小为497bp。

图2是样本1号的cyp2c19基因测序峰图。

图3是样本2号的cyp2c19基因测序峰图。

图4是样本3号的cyp2c19基因测序峰图。

图5是样本4号的cyp2c19基因测序峰图。

图2-5中a为cyp2c19681位点的测序峰图;b为cyp2c19636位点的测序峰图;c为cyp2c19-806位点的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

本发明的实施例1:

本实例中选取4名被测试人,各自在未刷牙未饮食摄水前咀嚼一块1.1cm×4.4cm的口香糖10分钟。咀嚼完毕的口香糖放入无菌冻存管中,分别标记为样本1、样本2、样本3和样本4。

提取样本的基因组dna:

(1)将口香糖咀嚼物,置于灭菌后的研钵中,加入适量液氮,快速进行研磨,至物质变为粉末状后,停止研磨;

(2)用无菌小勺将粉末状物质,置于含500μl裂解提取液的ep管中,充分震荡混匀;

(3)95℃水浴15分钟;

(4)在4℃环境内静置30分钟;

(5)4℃,12000rpm离心5分钟后取上清,4℃备用。

以基因组dna为模板进行cyp2c19基因特异pcr产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后结果显示条带清晰特异,扩增及测序成功率为100%。根据测序结果可知,样本1对应的基因型为(681gg,636gg,-806ct),属于超快代谢型;样本2对应的基因型为(681gg,636gg,-806cc),属于快代谢型;样本3对应的基因型为(681ag,636aa,-806cc),属于慢代谢型;样本4对应的基因型为(681ga,636gg,-806cc),属于中代谢型。

上述的具体实施方式只是示例性的,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。凡根据本发明精神实质所作的各种改动或修改,均落于本技术所附权利要求书所限定的范围。



技术特征:

技术总结
本发明涉及一种快速检测人类CYP2C19基因多态性的方法,所述方法是利用口香糖来黏附人口腔内脱落的上皮细胞,继而从口香糖咀嚼物中提取基因组DNA。DNA的提取包括以下步骤:将口香糖咀嚼物快速进行研磨;置于含裂解提取液的EP管中充分震荡混匀;金属浴或水浴;静置、离心后取上清;通过PCR‑DNA测序相结合的方法,判断被检测人CYP2C19基因多态性。本发明取材方便、送检便捷、且样品检测成功率高。

技术研发人员:杨比特
受保护的技术使用者:致远医学云检验(深圳)有限公司
技术研发日:2018.03.28
技术公布日:2019.10.11
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