本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种胶状溶杆菌oh17及其在植物生长中的应用。
背景技术：
：随着经济发展，人们对环境的破坏，土壤盐碱化、重金属污染、干旱以及有机物污染越来越严重，环境胁迫导致植物体内胁迫乙烯的大量积累，而过量的乙烯会导致植物生长受阻甚至死亡。如何有效提高植物的抗逆能力和增加农作物的产量已经成为了广泛关注的问题。溶杆菌广泛存在自然界中，常发现于土壤和水体中，菌体无鞭毛，基因组g+c含量较高，属于黄单胞科(xanthomonadaceae)，溶杆菌属(lysobacter)，能够产生多种胞外水解酶和小分子抗菌物质，对病原真菌、卵菌、酵母、细菌和线虫具有溶菌活性，是一类具有重要生防和药用潜力的细菌。1978年christensen和cook建立了溶杆菌属，并命名了四个种，分别为：产酶溶杆菌(l.enzymogenes)，抗生素溶杆菌(l.antibioticus)，变棕溶杆菌(l.brunescens)和胶状溶杆菌(l.gummosus)。1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)是乙烯的合成前体，acc脱氨酶可将acc分为α-丁酮酸和氨，可减少胁迫乙烯的产生，从而提高植物在逆境胁迫下的适应能力。胶状溶杆菌oh17为根际土壤中分离出的一种革兰氏阴性细菌，已于2013年12月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmccno.8649，分类命名为胶状溶杆菌lysobactergummosus，且该菌株对真菌和卵菌具有拮抗活性。授权公告号cn102816721b公开了一种产acc脱氨酶的根癌农杆菌ljl-6及其应用。该根癌农杆菌其分类命名为根癌农杆菌ljl-6(agrobacteriumtumefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.6289。该菌可以1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)为唯一氮源生长，同时将其分解。该细菌的acc脱氨酶活性最高可达4.86μmolα-ka·(mgpr·h)-1；随着l-trp的浓度增加其合成iaa的量增加；且可以合成嗜铁素。该菌株可在盐碱、干旱、金属、有机物污染等胁迫环境下提高植物的抗逆能力，促进植物生长；对石油污染的盐碱土中对燕麦的生长有促进作用。但该发明中并未明确在根癌农杆菌中acc脱氨酶所参与的具体代谢途径，acc脱氨酶在促进植物生长过程中植物根际乙烯含量变化情况，以及菌株在植物抗逆过程中的作用。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种胶状溶杆菌oh17及其在植物生长中的应用，本发明深入研究了acc脱氨酶在胶状溶杆菌oh17中所参与的代谢途径，胶状溶杆菌oh17菌株对于植物乙烯产生情况的影响，以及胶状溶杆菌oh17菌株在植物抵抗病原菌入侵过程中的作用，结果证明有效提高了植物的抗逆能力和增加农作物的产量。一种胶状溶杆菌oh17，其特征在于，含有合成1-氨基环丙烷-1-羧酸的胱硫醚γ-合酶基因和acc脱氨酶基因。上述胶状溶杆菌oh17在植物生长中的应用。作为改进的是，所述胶状溶杆菌oh17在植物在胁迫环境下通过抑制体内乙烯合成以提高抗逆能力中的应用。进一步改进的是，所述的胁迫环境包括盐碱地、旱地、被重金属污染的土地或被有机物污染的土地。作为改进的是，所述胶状溶杆菌oh17在水稻中抗稻瘟病菌、水稻纹枯病菌或水稻纹枯病菌中的应用。胶状溶杆菌oh17，革兰氏阴性细菌，已于2013年12月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmccno.8649，分类命名为胶状溶杆菌lysobactergummosus。有益效果与现有技术相比，本发明一种胶状溶杆菌oh17及其在植物生长中的应用具有如下优势：1、检验结果表明，胶状溶杆菌oh17是具有胱硫醚γ-合酶基因和acc脱氨酶基因的菌株；2、由于胶状溶杆菌oh17能合成acc脱氨酶，有效抑制植物体内acc的合成，降低因环境胁迫所导致植物体内乙烯的大量积累，从而提高其抗逆性；3、胶状溶杆菌oh17能有效改善植物的生长，与对照组相比，植物的根长增加10％，茎长增加了15％，植物根部有较多根毛生成。附图说明图1为胶状溶杆菌oh17中acc合成途径示意图；图2为高效液相色谱对胶状溶杆菌oh17分泌的acc检测图，其中，a为marfey′sreagent标记的acc标准品；b为marfey′sreagent标记的胶状溶杆菌oh17上清；c为marfey′sreagent标记的胶状溶杆菌oh17disruptionpeg_1256菌株上清，阴性对照；；图3为实施例1中被marfey′sreagent标记的acc的质谱图；图4为高效液相色谱对胶状溶杆菌oh17分泌的2-酮丁酸检测图，其中，a为标记的2-酮丁酸标品，b为标记的胶状溶杆菌oh17细胞破碎液；图5为peg_1256氨基酸序列blastp同源性比对结果图，以ncbiblastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行蛋白同源性比对，获得有关氨基酸序列功能信息；图6为peg_1256氨基酸序列结构域分析图；图7为peg_5321氨基酸序列blastp同源性比对结果图，以ncbiblastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行蛋白同源性比对，获得有关氨基酸序列功能信息；图8为peg_5321氨基酸序列结构域分析图；图9为不同菌株产生2-酮丁酸的含量图，其中，peg_5321为在野生型中过表达胱硫醚γ-合酶基因，peg_1256为在野生型中过表达acc脱氨酶基因，control为胶状溶杆菌oh17，disruptionpeg_1256为acc脱氨酶基因插入失活菌株；图10为不同菌株培养产生acc的含量图，其中，peg_5321为在野生型中过表达胱硫醚γ-合酶基因，peg_1256为在野生型中过表达acc脱氨酶基因，control为胶状溶杆菌oh17，disruptionpeg_1256为acc脱氨酶基因插入失活菌株；图11为不同处理组日本晴水稻产生乙烯情况检测；图12为不同处理组日本晴水稻的茎和根的生长情况测定；其中，a为日本晴水稻茎长，b为日本晴水稻根长；图13为不同处理组日本晴水稻根毛在4倍镜图；图14为不同处理组日本晴水稻根毛在10倍镜图；图15为大肠杆菌表达acc脱氨酶催化活性检测图；图16为胶状溶杆菌在水稻抵抗病过程中的作用后的数据图，其中，control为接种植物基本液体培养基的对照组，treated为接种胶状溶杆菌oh17的处理组，a为水稻抗稻瘟病菌能力检测；b为水稻抗水稻纹枯病菌能力检测；c为水稻抗水稻白叶枯病菌能力检测。具体实施方式下面结合具体实例对本发明的发酵方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。实施例1将10l胶状溶杆菌oh17发酵上清进行减压蒸馏浓缩至300ml，按表1中的反应体系标记acc，置于37℃、180rpm反应2小时，利用高效液相色谱对反应后上清液进行检测，所用检测仪器为shimadzums-2020，色谱柱为c-18column，检测波长为350nm，检测温度为35℃，以乙腈为流动相，流动相检测条件如表2所示。参照物为marfey′sreagent标记的acc标准品。表1marfey′sreagent标记acc反应体系试剂体积/μl上清1001m碳酸氢钠40marfey′sreagent100表2高效液相色谱工作的条件时间乙腈体积浓度0-60分钟0％-60％60-70分钟90％70-75分钟0％结果如图2所示，从高效液相色谱的峰值来看，a为marfey′sreagent标记的acc标准品，阳性对照，marfey′sreagent标记的acc标准品在40.2分钟出峰；b为marfey′sreagent标记的胶状溶杆菌oh17上清，胶状溶杆菌oh17发酵上清在5.8分钟位置具有与a相同的峰，初步判定胶状溶杆菌oh17发酵上清中的确含有acc。进一步收集marfey′sreagent标记的胶状溶杆菌oh17发酵上清在40.2分钟位置的样品，进行质谱检测，结果发现其分子量与标准品acc分子量相同([m+na]+＝346.1053，图3)，确认胶状溶杆菌oh17发酵上清中的确含有acc。实施例2将30mlod600≈2的胶状溶杆菌oh17发酵液超声破碎(ultrasonichomogenizer,scientz-iid)20分钟，6000rpm离心5分钟，吸取细胞破碎液上清进行减压蒸馏浓缩至5ml，取上述浓缩后的细胞破碎液上清，按照表3中的反应体系标记2-酮丁酸，置于80℃反应1小时。用高效液相色谱进行检测反应后的上清液，检测仪器为shimadzums-2020，色谱柱为c-18column，检测波长为450nm，以乙腈为流动相，流动相检测条件如下表4所示。表3标记2-酮丁酸反应体系试剂体积/μl细胞破碎液上清1200.1m1,2-苯二胺200.2m亚硫酸氢钠20表4高效液相色谱工作的条件时间乙腈体积浓度0分钟0％0-60分钟0％-60％60-70分钟60％-90％70-75分钟90％-0％从高效液相色谱分析可知，a为标记的2-酮丁酸标品，在31.7分钟出峰；b为标记的胶状溶杆菌oh17细胞破碎液，在31.7分钟位置具有相同的峰，初步判定胶状溶杆菌oh17发酵上清中的确含有2-酮丁酸。实施例3分别以ec3.5.99.7(pseudomonasentomophila)及ec2.5.1.48(cicerarietinum)的氨基酸序列，利用bioedit(version7.0.9.0)进行序列比对，寻找胶状溶杆菌oh17菌株中的相应功能基因。比较结果如图5和图7所示，其中图5为peg_1256与来自phytophthorasojae(uniprot:g5afq7),azospirillumlipoferum(uniprot:q1g755),bradyrhizobiumdiazoefficiens(uniprot:q89xr6)和pseudomonasentomophila(uniprot:c3vp48)中的acc脱氨酶氨基酸序列进行同源性比对，peg_1256具有62％的氨基酸同源性。图7为peg_5321与来自cicerarietinum(uniprot:l0ek12),mycobacteriumulcerans(uniprot:a0pkt3)和helicobacterpylori(uniprot:q1m0p5)的胱硫醚γ-合酶氨基酸序列进行同源性比对，peg_5321具有59％的氨基酸同源性。进一步对所找到的基因进行蛋白结构域分析发现，peg_1256具有acc脱氨酶特征性的蛋白结构域(图6)，peg_5321具有胱硫醚γ-合酶特征性的蛋白结构域(图8)，初步判定peg_1256为acc脱氨酶，peg_5321为胱硫醚γ-合酶。氨基酸序列比对及蛋白结构域分析中所用的技术和试剂均为常用的。实施例4根据实施例3中比对获得的peg_1256及peg_5321基因，设计引物对两个基因进行载体的过表达。引物序列如下表3所示。表5载体的过表达所用引物序列表引物序列5321-mcs-15’-cccaagcttcatgtccgccgatccgatcgc-3’5321-mcs-25’-tgctctagatcagaagtgcaagccttcgc-3’1256-mcs-15’-cccaagcttcccgccaatctacgccacctcg-3’1256-mcs-25’-tgctctagactatgcacccaagcgaggcgccgatcg-3’试剂：tksgflextmdnapolymerase(takara，r060q)pcr反应体系如表6所示。表6pcr反应体系pcr反应程序如表7所示。表7pcr程序所选参数表扩增出的片段、载体pbbr1-mcs5均利用xbai、hindiii进行酶切，酶连后电转化入dh5ɑλpir菌株中，筛选携带重组质粒的菌株，将重组质粒提取后进行酶切检测，并将质粒送金斯瑞生物科技有限公司对扩增片段进行sanger测序，将测序结果与胶状溶杆菌oh17全基因组比对，保证重组载体上无碱基突变，将比对正确的质粒电转化至胶状溶杆菌oh17中，用抗性lb平板筛选正确转化子，完成过表达菌株的构建。通过对acc脱氨酶基因及胱硫醚γ-合酶基因的过表达，为后续在过表达菌株中检测2-酮丁酸和acc奠定基础，并验证acc脱氨酶基因及胱硫醚γ-合酶基因的功能。构建过程中所用的技术和试剂均为常用的。实施例5根据实施例3中比对获得的peg_1256，在基因内部选取约500bp片段，设计引物，将目标片段扩增及酶切后连接至自杀质粒pjq200sk，通过同源重组的方式，将载体交换插入至胶状溶杆菌oh17的peg_1256基因内部，完成peg_1256插入失活菌株的构建。所用引物序列如下表8所示。表8peg_1256插入失活菌株的构建引物序列表引物序列1256-pjq-15’-cgcggatccttcgaaaacgacctggcccat-3’1256-pjq-25’-tgctctagaacagcacataggtgcggttgcc-3’试剂：tksgflextmdnapolymerase(takara，r060q)pcr反应体系如表9所示。表9pcr反应体系试剂体积/μl2×gflexpcrbuffer251256-pjq-111256-pjq-21templatedna1tksgflexdnapolymerase1灭菌蒸馏水至50pcr反应程序如表10所示。表10pcr程序扩增出的片段、载体pjq200sk利用xbai、bamhi进行酶切，酶连后电转化入dh5ɑλpir菌株中，筛选携带重组质粒的菌株，将重组质粒提取后进行酶切检测，并将质粒送金斯瑞生物科技有限公司对扩增片段进行sanger测序，将测序结果与胶状溶杆菌oh17全基因组比对，保证重组载体上无碱基突变，将比对正确的质粒电转化至胶状溶杆菌oh17中，用抗性lb平板筛选正确转化子，完成peg_1256插入失活菌株的构建。构建过程中所用的技术和试剂均为常用的。实施例6利用实施例3中获得的peg_1256，设计大肠杆菌表达载体，所用引物序列为表11所示。表11peg_1256大肠杆菌表达载体引物序列表引物序列1256-pcold-15’-gggaattccatatgtccgccgatccgatcgc-3’1256-pcold-25’-gacaagctttcagaagtgcaagccttcgcgcccggcgat-3’试剂：tksgflextmdnapolymerase(takara，r060q)pcr反应体系如表12所示。表12pcr反应体系试剂体积/μl2×gflexpcrbuffer251256-pcold-111256-pcold-21templatedna1tksgflexdnapolymerase1灭菌蒸馏水至50pcr反应程序如表13所示。表13pcr程序扩增出的片段、载体pcold-sumo利用ndei、hindiii进行酶切，酶连后电转化入dh5ɑλpir菌株中，筛选携带重组质粒的菌株，将重组质粒提取后进行酶切检测，并将质粒送金斯瑞生物科技有限公司对扩增片段进行sanger测序，将测序结果与胶状溶杆菌oh17全基因组比对，保证重组载体上无碱基突变，将比对正确的质粒电转化至bl21(de3)中，用抗性lb平板筛选正确转化子，完成大肠杆菌表达菌株的构建。构建过程中所用的技术和试剂均为常用的。比较实施例4-6构建的不同菌株产生2-酮丁酸的量，结果如图9所示，其中peg_5321为在野生型中过表达胱硫醚γ-合酶基因，peg_1256为在野生型中过表达acc脱氨酶基因，control为胶状溶杆菌oh17，disruptionpeg_1256为acc脱氨酶基因插入失活菌株。结果显示，野生型中2-酮丁酸的产量为0.10mg/l，在野生型中过表达胱硫醚γ-合酶基因使得2-酮丁酸的产量提高到0.18mg/l，由于胱硫醚γ-合酶能够以o-丁二酰-l-高丝氨酸为底物催化合成2-酮丁酸，进而导致了2-酮丁酸含量的增加；在野生型中过表达acc脱氨酶基因使得2-酮丁酸的产量提高到0.14mg/l，由于acc脱氨酶具有双重活性，既能够以2-酮丁酸为底物催化合成acc，也能够以acc为底物催化合成2-酮丁酸，进而导致了2-酮丁酸含量的增加；在acc脱氨酶基因插入失活菌株中，2-酮丁酸的产量提高到0.60mg/l，由于acc脱氨酶功能丧失，导致无法以2-酮丁酸为底物合成acc，使得2-酮丁酸大量积累。比较实施例4至实施例6构建的不同菌株产生acc的量，结果如图10所示，其中peg_5321为在野生型中过表达胱硫醚γ-合酶基因，peg_1256为在野生型中过表达acc脱氨酶基因，control为胶状溶杆菌oh17，disruptionpeg_1256为acc脱氨酶基因插入失活菌株。结果显示，野生型中的acc的产量为2.97mg/l，在野生型中过表达胱硫醚γ-合酶基因及acc脱氨酶后，使得acc产量分别提高到4.17mg/l和5.12mg/l，并且在acc脱氨酶基因插入失活菌株中，无法检测到acc的合成。根据以上实施例4-6中对野生型菌株、过表达菌株及acc脱氨酶基因插入失活菌株中2-酮丁酸和acc含量的测定可以证明，在胶状溶杆菌中acc的代谢通路为：以o-丁二酰-l-高丝氨酸为底物，在胱硫醚γ-合酶催化下合成2-酮丁酸；以2-酮丁酸为底物，在acc脱氨酶催化下合成acc；同时，也可以acc为底物，在acc脱氨酶催化下合成2-酮丁酸。实施例7将日本晴水稻在植物基本液体培养基(200mg葡萄糖、100mg氯化铵、100mg氯化镁、100mg氯化钙溶解于1l去离子水中)中培养7-8天(光照12hr/天，28℃-30℃)，将上述日本晴水稻转移至20ml顶空瓶中，加入1ml植物基本液体培养基，反应1天后，利用气相色谱检测顶空瓶内的乙烯含量。检测仪器为agilenttechnologies7890a，色谱柱为agilenthp-plot-qcolumn，fid检测器，色谱柱温度条件如下：表14气相色谱检测条件时间色谱柱温度0-1分钟32℃1-2分钟32℃-70℃2-3分钟70℃3-12分钟70℃-160℃检测结果如图11所示，其中，oh17处理组为在植物基本液体培养基中接种胶状溶杆菌oh17菌株(106cells/ml)；control为植物基本液体培养基，不添加菌株；acc处理组为在植物基本液体培养基中加入1.2mg/lacc，不添加菌株；oh17’处理组为在植物基本液体培养基中接种胶状溶杆菌disruptionpeg_1256菌株。结果发现，只加植物基本液体培养基，不添加菌株的对照组，乙烯浓度为0.14-0.16ppb，接种胶状溶杆菌oh17菌株处理组，乙烯浓度为0.25ppb，并且加入1.2mg/lacc处理组和oh17’处理组中植物产生的乙烯浓度与对照组之间没有显著性差异。以上结果表明，胶状溶杆菌oh17的acc脱氨酶能够促进水稻内源性的acc浓度降低，使得植物产生的乙烯提高了44％，进一步证明了acc脱氨酶能够影响水稻植物的生长代谢。在检测植物产生乙烯的同时，检测水稻植物的根长与茎长。其中oh17为接种胶状溶杆菌oh17菌株处理组，control为只加植物基本液体培养基，不添加菌株的对照组，acc为加入1.2mg/lacc，不添加菌株的处理组，oh17’为接种disruptionpeg_1256为acc脱氨酶基因插入失活菌株处理组。检测结果如图12-14所示，只加植物基本液体培养基，不添加菌株的对照组，水稻根为8.42±0.99cm，茎长为13.34±0.45cm；加入1.2mg/lacc，不添加菌株的处理组，水稻根为8.48±0.80cm，茎长为11.69±0.62cm；接种acc脱氨酶基因插入失活菌株处理组，水稻根为13.38±0.52cm，茎长为831±1.03cm；接种胶状溶杆菌oh17菌株处理组，水稻根为14.80±0.18cm，茎长为9.80±0.99cm，较对照组，接种胶状溶杆菌oh17菌株处理组在水稻根长与茎长分别提升了10％和15％。图13-14是不同处理组日本晴水稻根毛分别为4倍镜和10倍镜的图片，其中，a均为接种胶状溶杆菌oh17菌株的植物基本液体培养基；b均为植物基本液体培养基；c均为加入1.2mg/lacc的植物基本液体培养基；d均为接种胶状溶杆菌disruptionpeg_1256菌株的植物基本液体培养基。从图中可以看出，较只加植物基本液体培养基，不添加菌株的对照组，接种胶状溶杆菌oh17菌株处理组形成更多的根毛，根毛可以为植物提供营养，因此植物可以更快的生长；1.2mg/lacc的植物基本液体培养基与对照组之间，根毛生长没有显著性变化。实施例8将实施例6中所构建的大肠杆菌表达acc脱氨酶基因的菌株活化至od600≈0.6，加入iptg至终浓度0.5mm，28℃、180rpm诱导4小时，利用his-标签蛋白纯化试剂盒(takara，635710)纯化目标acc蛋白。将纯化的acc脱氨酶加入到表15的反应体系中，其中含有0.1m的acc，至于37℃，180rpm，反应24小时后取1μl点样于tlc薄层层析板上，展开剂(v/v/v)为乙酸乙酯：甲醇：乙酸＝2:2:1，以茚三酮为显色剂进行显色观察。表15以acc为底物检测acc脱氨酶活性的反应体系将acc脱氨酶加入表16的反应体系，至于37℃，180rpm，反应24小时后取1μl点样于tlc薄层层析板上，展开剂(v/v/v)为乙酸乙酯：甲醇：乙酸＝2:2:1，以茚三酮为显色剂进行显色观察。表16以2-酮丁酸为底物检测acc脱氨酶活性的反应体系试剂体积0.1m2-酮丁酸10μl氨水(ph＝8.0)150μlacc脱氨酶323μg灭菌蒸馏水至200μl结果如图15所示，图中，a以acc为底物，加入acc脱氨酶，利用tlc检测不同时间段的acc含量的变化。b以2-酮丁酸为底物，加入acc脱氨酶，利用tlc检测不同时间段的acc含量的变化。c检测bl21(de3)表达acc脱氨酶基因的表达情况。结果发现，acc脱氨酶在以acc为底物时，能够催化acc产生2-酮丁酸；以2-酮丁酸为底物时，催化2-酮丁酸产生acc。实施例9将日本晴水稻在植物基本液体培养基(200mg葡萄糖、100mg氯化铵、100mg氯化镁、100mg氯化钙溶解于1l去离子水中)中培养30天(光照12hr/天，28℃-30℃)，其中，在处理组的植物基本液体培养基中加入胶状溶杆菌oh17菌株(106cells/ml)，对照组不接种任何菌株。30天后，利用注射器分别吸取1mlod600≈1.0的稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌接种至水稻叶片上，继续培养7-10天，观察叶片上病斑长度。结果如图16所示，其中，a是在接种稻瘟病菌后，在只加植物基本液体培养基，不添加胶状溶杆菌oh17菌株(即control组)的对照组中，病斑长度为27.2±5.6mm，而接种胶状溶杆菌oh17菌株的处理组(即treated组)，病斑长度为8.5±4.1mm，较对照组降低了68.75％；b是在接种水稻纹枯病菌后，在只加植物基本液体培养基，不添加菌株的对照组中，病斑长度为24.3±1.3mm，而接种胶状溶杆菌oh17菌株的处理组，病斑长度为4.9±2.0mm，较对照组降低了79.83％；c是在接种水稻纹枯病菌后，在只加植物基本液体培养基，不添加菌株的对照组中，病斑长度为51.3±1.8mm，而接种胶状溶杆菌oh17菌株的处理组，病斑长度为8.2±2.6mm，较对照组降低了84.02％。在接种胶状溶杆菌oh17菌株后，能够显著性提升日本晴水稻对于三种病原菌的抗性。序列表<110>江苏省农业科学院<120>一种胶状溶杆菌oh17及其在植物生长中的应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>30<212>dna<213>manualsequence<400>1cccaagcttcatgtccgccgatccgatcgc30<210>2<211>29<212>dna<213>manualsequence<400>2tgctctagatcagaagtgcaagccttcgc29<210>3<211>31<212>dna<213>manualsequence<400>3cccaagcttcccgccaatctacgccacctcg31<210>4<211>36<212>dna<213>manualsequence<400>4tgctctagactatgcacccaagcgaggcgccgatcg36<210>5<211>30<212>dna<213>manualsequence<400>5cgcggatccttcgaaaacgacctggcccat30<210>6<211>31<212>dna<213>manualsequence<400>6tgctctagaacagcacataggtgcggttgcc31<210>7<211>31<212>dna<213>manualsequence<400>7gggaattccatatgtccgccgatccgatcgc31<210>8<211>39<212>dna<213>manualsequence<400>8gacaagctttcagaagtgcaagccttcgcgcccggcgat39当前第1页12