本发明涉及一种生物活性肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽及其制备方法和用途。
背景技术：
马面鲀是我国的一种常见鱼类。马面鲀皮较厚且硬，故捕捞后，若时间允许，即就地扒皮，其肉入库冷藏，待食用，其皮就地扔掉，造成资源的浪费和环境污染。目前，已有研究利用马面鱼皮用于制革工业、制备胶原蛋白，以及分离纯化精氨酸和脯氨酸。而以马面鲀鱼皮为原料，利用酶解技术进行胶原肽的开发，也将为马面鲀鱼皮的高值化利用奠定基础。
但是，目前以马面鲀鱼皮为原料，利用酶解技术制备马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性鱼肉抑菌肽及其应用更是未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种制备工艺简单，通过酶解或水解的方法，特异性地获得具有抑菌效果的水解多肽；通过超声波或微波等方法，促进蛋白酶对鱼皮蛋白的作用效果，从而实现抑菌肽高效制备的马面鲀鱼皮抑菌肽的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种马面鲀鱼皮抑菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a）鱼皮预处理：将马面鲀鱼皮绞碎，然后依次进行脱脂和脱钙得到脱脂、脱钙鱼皮；然后再进行脱非胶原蛋白，得到脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白马面鲀鱼皮；
b）酶解：将充分干燥的脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白马面鲀鱼皮按照料液比1g:8—12ml加入到缓冲液中，调ph值至6.5—7.5，于45—55℃保温10—15min，按照鱼皮质量的2—5%加入复合蛋白酶，于45—55℃酶解4—6h；
c）抑菌肽的制备：将酶解液于沸水浴中灭活10—15min，然后通过超声波提取或微波提取上清液；上清液依次经超滤、层析或超滤、喷雾干燥，得到马面鲀鱼皮抑菌肽。
作为优选：所述的步骤a）中，将马面鲀鱼皮绞碎，按照料液比1g:2—5ml加异丙醇，于4℃下浸泡4—6h，每1h换异丙醇一次，得脱脂鱼皮；脱脂鱼皮于35—40℃充分干燥后，按照料液比1g:5—7ml加入0.5mol/ledta-2na溶液，于4℃下浸泡3—5天，每天更换1-2次edta-2na溶液，得脱脂、脱钙鱼皮；脱脂、脱钙鱼皮在35—40℃充分干燥后按照料液比1g:15—20ml加0.1mol/lnaoh溶液于4℃下浸泡4—6h，每1-2h换naoh溶液一次，得脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白鱼皮，于35—40℃充分干燥；
所述的步骤b）中，所述的复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶按照重量比1：1—3混合形成；所述的缓冲液为0.05mol/l的甘氨酸-naoh缓冲液；
所述步骤c）中，所述的超声波提取条件为工作频率25——85khz，时间15—95min或微波提取条件为工作频率1000—2000mhz，时间15—95min；
所述的超滤是采用截留分子量为6kda和2kda的超滤膜进行超滤处理，对步骤b）所得的酶解液进行不同分子量肽段截留，获得分子量在2kda—6kda之间的肽段组分，得超滤酶解物；
所述的层析是将上述超滤酶解物用deae-52纤维素的阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶g-15凝胶进行分离和纯化，得到马面鲀鱼皮抑菌肽。
本发明具有制备工艺简单，通过酶解或水解的方法，特异性地获得具有抑菌效果的水解多肽；通过超声波或微波等方法，促进蛋白酶对鱼皮蛋白的作用效果，从而实现抑菌肽高效制备等特点。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：一种马面鲀鱼皮抑菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a）鱼皮预处理：将马面鲀鱼皮绞碎，然后依次进行脱脂和脱钙得到脱脂、脱钙鱼皮；然后再进行脱非胶原蛋白，得到脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白马面鲀鱼皮；
b）酶解：将充分干燥的脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白马面鲀鱼皮按照料液比1g:8—12ml加入到缓冲液中，调ph值至6.5—7.5，于45—55℃保温10—15min，按照鱼皮质量的2—5%加入复合蛋白酶，于45—55℃酶解4—6h；
c）抑菌肽的制备：将酶解液于沸水浴中灭活10—15min，然后通过超声波提取或微波提取上清液；上清液依次经超滤、层析或超滤、喷雾干燥，得到马面鲀鱼皮抑菌肽。
本发明在上述公开的基础上，进一步的优选实施例是：
所述的步骤a）中，将马面鲀鱼皮绞碎，按照料液比1g:2—5ml加异丙醇，于4℃下浸泡4—6h，每1h换异丙醇一次，得脱脂鱼皮；脱脂鱼皮于35—40℃充分干燥后，按照料液比1g:5—7ml加入0.5mol/ledta-2na溶液，于4℃下浸泡3—5天，每天更换1-2次edta-2na溶液，得脱脂、脱钙鱼皮；脱脂、脱钙鱼皮在35—40℃充分干燥后按照料液比1g:15—20ml加0.1mol/lnaoh溶液于4℃下浸泡4—6h，每1-2h换naoh溶液一次，得脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白鱼皮，于35—40℃充分干燥；
所述的步骤b）中，所述的复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶按照重量比1：1—3混合形成；所述的缓冲液为0.05mol/l的甘氨酸-naoh缓冲液；
所述步骤c）中，所述的超声波提取条件为工作频率25——85khz，时间15—95min或微波提取条件为工作频率1000—2000mhz，时间15—95min；
所述的超滤是采用截留分子量为6kda和2kda的超滤膜进行超滤处理，对步骤b）所得的酶解液进行不同分子量肽段截留，获得分子量在2kda—6kda之间的肽段组分，得超滤酶解物；
所述的层析是将上述超滤酶解物用deae-52纤维素的阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶g-15凝胶进行分离和纯化，得到马面鲀鱼皮抑菌肽。
本发明在上述实施例公开的基础上，通过简单的数值替换和常规技术手段的替换，能够获得无数个实施例，且本领域技术人员在了解本发明的基础上，能够方便地实施本发明。