本发明属于环境污染水体富营养化生物-生态修复技术领域，具体涉及一株中温好氧反硝化脱氮除磷菌及其在富营养化污染水体氮磷生物处理中的应用。
背景技术：
水体富营养化是指水体中氮磷等营养盐含量过多而引起的水质污染现象。在人类活动的影响下，人为排放含生物所需的氮磷等营养物质的工业废水和生活污水大量进入湖泊、河流和海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡。富营养水体中大量繁殖的藻类浮在水体表面，使水质变得浑浊，导致水体透明度明显降低，加速了湖泊等缓流水体环境的退化，常常表现为“赤潮”和“水华”等现象。然而，水库和湖泊是重要的城市供水水源，约占我国城市日供水量的1/4。因富营养化水中含有硝酸盐和亚硝酸盐，人畜长期饮用这些物质含量超过一定标准的水，也会中毒致病。水体富营养化问题已成为亟待解决的环境问题之一，也是目前研究的热点。
目前对于大多数富营养化污水处理都是应用最为广泛的生物处理工艺，传统的生物处理技术主要依靠好氧和厌氧两类微生物，在缺(厌)氧区和好氧区分别实现脱氮和除磷。由于生物脱氮除磷过程存在着难以协调的竞争和矛盾，使得脱氮除磷率提高受限，且实现同时脱氮除磷比较困难。随着好氧反硝化聚磷菌的分离发现，证实反硝化可以在有氧条件下进行。并且，好氧反硝化菌进行反硝化作用的硝酸盐还原酶，是周质硝酸盐还原酶而并不是膜内硝酸盐还原酶。在已经提出来的好氧反硝化菌的假想的呼吸途径里，电子既可以传递给o2，亦可传递给no3-、no2-和n2o，这表明好氧反硝化菌可以利用硝酸盐氮取代o2作为氧化phb(聚β-羟基丁酸)的电子受体，同时完成反硝化脱氮和过量摄磷这2个彼此独立的过程，从而实现了“一碳两用”，大大地解决了传统脱氮除磷工艺中反硝化菌和聚磷菌之间存在的碳源竞争、泥龄差异等问题。因此，筛选分离出好氧反硝化脱氮除磷菌突破了原有生物脱氮除磷技术的固有工作模式，使得脱氮除磷工艺有了新的发展，这对于治理和修复富营养化污染水体具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株中温好氧反硝化脱氮除磷菌及其分离方法和应用。
本发明好氧反硝化脱氮除磷菌于2017年12月11日在中国微生物菌种保藏管委会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为no.15044，该菌株16srdna的genbank登录号为mf667015；所述中温好氧反硝化脱氮除磷菌经鉴定为大肠埃希氏菌(escherichiacoli).j16来自某污水处理厂好氧生化池的活性污泥，经人工富集驯化培养，分离纯化得到，命名为j16。该菌革兰氏染色阴性，细胞为短杆状，细菌菌落呈圆形，大小为1-1.2mm，乳白色，表面光滑，边缘整齐，微隆起，有光泽，不透明，其最适生长条件为：ph7.2-8.0，温度30-35℃。
本发明中温好氧反硝化脱氮除磷菌的分离方法，包括以下步骤：
(1)、从污水处理厂好氧生化池取得新鲜活性污泥，经自然沉降浓缩后去除上清液，将剩余的活性污泥混合液在磁力搅拌器上进行捣碎，待泥水混合物静置2h后，取其上清液10ml于装有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，用纱布封口，置于恒温振荡培养箱内，于30℃和150r/min条件下振荡活化培养24h；
(2)、用无菌移液枪吸取富集培养后的混合液10ml于装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，加入若干玻璃珠，于30℃摇床上培养30min以稀释打散菌胶团，形成稀释混合液样品，再采用无菌水将稀释混合液样品制成不同浓度梯度的菌悬液，再分别吸取各浓度梯度的稀释液0.2ml，涂布于yg培养基上，用无菌三角玻璃刮刀在培养基表面均匀涂布，每个稀释度重复3次，然后将稀释涂布后的培养基平板倒置于30℃的恒温培养箱中培养48h后，从几个稀释梯度的平板中挑选出形态不同的菌落，于yg固体培养基平板上进行划线分离纯化，直到得到菌落特征一致的单株菌落；
(3)将步骤(2)中所得单一菌株转接至lb斜面培养基上，于30℃培养箱中培养3d，将所有的斜面试管取出，放于4℃冰箱中保存备用；
(4)选取分离、纯化后所得的斜面菌种，分别点接于限磷和过磷的葡萄糖-mops培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养1-2d，观察蓝白斑的生长情况，选取同时在两种培养基上都产生蓝斑的菌落为初选菌株；
(5)将初选菌株接种于合成废水培养基中，于30℃和150r/min的条件下恒温振荡培养24h后，经6000r/min离心15min，按总磷测定法测定上清液的磷含量，取吸磷率高于50％的菌株进行硝酸盐还原产气实验；其中合成废水培养基的组成为：葡萄糖0.4g，蛋白胨0.1g，酵母膏0.01g，ch3coona0.25g，nacl0.05g，k2hpo40.07g，mgso4·7h2o0.15g，nh4cl0.18g，h2o1000ml，ph7.2；硝酸盐还原产气培养基的组成为：3g牛肉膏，5g蛋白胨，1gkno3，1000mlh2o，ph7.2；
(6)经硝酸盐产气试验得到的能产气的菌株投入到富氮富磷培养基中，于30℃和150r/min条件下振荡培养24h后，进行离心，分别用钼锑抗分光光度法和麝香草酚分光光度法测定上清液中po43--p和no3--n含量的变化，最终得到一株高效的中温好氧反硝化脱氮除磷菌j16。
优选地，本发明所述步骤(1)中富集培养基的组成为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，h2o1000ml，ph7.0-7.2；步骤(1)中封口时采用的纱布为九层纱布。
优选地，本发明所述步骤(2)中所述不同浓度梯度的菌悬液的浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，步骤(2)中所述yg固体培养基的组成为：酵母膏1g，葡萄糖1g，k2hpo40.3g，kh2po40.25g，mgso40.2g，琼脂20g，h2o1000ml，ph7.0-7.2；所述步骤(3)中lb斜面培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，琼脂18g，h2o1000ml，ph7.0-7.2。
优选地，本发明步骤(4)中葡萄糖-mops培养基的组成为：100ml的10×mops混合物(8.372gmops+0.717gtricine+30ml去离子水，10mol/l的koh调节ph至7.4，总体积到44ml，加入1ml新制的0.01％的feso4溶液，按下列顺序加溶液：5ml-1.9mol/l的nh4cl，1ml-0.276mol/l的k2so4，0.025ml-0.02mol/l的cacl2·2h2o，0.21ml-2.5mol/l的mgcl2·6h2o，10ml-5mol/l的nacl，0.02ml微量元素混合液，38.7ml去离子水)，0.1g葡萄糖；
所述蓝白斑筛选培养基的组成为：①各取25ml葡萄糖-mops培养基置于两个250ml的三角瓶中，向一个三角瓶中加入0.00435gk2hpo4和x-pi(50ug/ml)成为限磷培养基；向另一个瓶中加入0.0866gk2hpo4和x-pi(50ug/ml)成为过磷培养基，向两种培养基中均加入vb1(1g/l)溶液0.05ml和无菌水75ml，过滤灭菌分装；②取250ml的三角瓶两个，分别加入去离子水150ml和琼脂5g，在121℃下高压灭菌30min，冷却至50℃以下，然后将过滤灭菌好的葡萄糖-mops培养基倒入，摇匀倒平板；微量元素混合液的组成为：0.09g(nh4)6mo7o24，0.62gh3bo3，0.18gcacl2，0.06gcuso4，0.40gmncl2，0.07gznso4，1000mlh2o。
优选地，本发明所述步骤(6)中富氮富磷培养基的组成为：3.32gch3coona·3h2o，152.8mgnh4cl，50mgk2hpo4，91.26mgmgso4·7h2o，25.68mgcacl2·2h2o，500mgkno3，8.5gpipes缓冲液，2ml微量元素，10mgnacl，1000mlh2o，ph7.2；微量元素溶液的组成为：63.7gna2edta，5.06gmncl2·4h2o，5.0gfeso4·7h2o，2.2gznso4，5.5gcacl2，1.1gna2moo4·4h2o，1.57gcuso4·5h2o，1.61gcocl2·6h2o，1000mlh2o，ph7.2。
本发明中温好氧反硝化脱氮除磷菌用于除去富营养化污染水体中的磷和氮。
本发明对中温好氧反硝化脱氮除磷菌在修复富营养化污染水体中除磷的应用进行了测试，将该菌株按3％的接种量接种于初始po43--p浓度为8.9mg/l的富氮富磷合成废水中，培养24h后上清液中po43--p浓度降低到0.35mg/l，除磷率可达到96.03％。
本发明中温好氧反硝化脱氮除磷菌在修复富营养化污染水体中脱氮的应用进行了测试，，将该菌株按3％的接种量接种于初始no3--n浓度为69.31mg/l的富氮富磷合成废水中，培养24h后上清液中no3--n浓度降低到3.78mg/l，脱氮率可达到94.55％。
具体实施方式
实施例1
中温好氧反硝化脱氮除磷菌的分离方法包括以下步骤：
(1)从某污水处理厂好氧生化池取得新鲜的活性污泥，经自然沉降浓缩后去除上清液，将剩余的活性污泥混合液在磁力搅拌器上进行捣碎，待泥水混合物静置2h后，取其上清液10ml于装有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，用九层纱布封口(以保证供给充足的氧气)，置于恒温振荡培养箱内，于30℃和150r/min条件下振荡活化培养24h，其中富集培养基组成为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，h2o1000ml，ph7.0-7.2。
(2)用无菌移液枪吸取富集培养后的混合液10ml于装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，加入若干玻璃珠，于30℃摇床上培养30min以稀释打散菌胶团。用无菌移液枪分别吸取0.5ml稀释混合液样品于装有4.5ml无菌水的试管中，混匀，依次类推，制成浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液。分别吸取各浓度梯度的稀释液0.2ml，涂布于yg培养基上，用无菌三角玻璃刮刀在培养基表面均匀涂布，每个稀释度重复3次。然后将稀释涂布后的培养基平板倒置于30℃的恒温培养箱中培养48h后，从几个稀释梯度的平板中挑选出形态不同的菌落，于yg固体培养基平板上进行划线分离纯化，直到得到菌落特征一致的单株菌落。其中yg固体培养基的组成为：酵母膏1g，葡萄糖1g，k2hpo40.3g，kh2po40.25g，mgso40.2g，琼脂20g，h2o1000ml，ph7.0-7.2。
(3)而后将步骤(2)中所得单一菌株转接至lb斜面培养基上，于30℃培养箱中培养3d，将所有的斜面试管取出，放于4℃冰箱中保存备用。其中lb斜面培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，琼脂18g，h2o1000ml，ph7.0-7.2。
(4)选取分离、纯化后所得的斜面菌种，分别点接于限磷和过磷的葡萄糖-mops培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养1-2d。观察蓝白斑的生长情况，选取同时在两种培养基上都产生蓝斑的菌落为初选菌株。其中葡萄糖-mops培养基的组成为：100ml的10×mops混合物(8.372gmops+0.717gtricine+30ml去离子水，10mol/l的koh调节ph至7.4，总体积到44ml，加入1ml新制的0.01％的feso4溶液，按下列顺序加溶液：5ml-1.9mol/l的nh4cl，1ml-0.276mol/l的k2so4，0.025ml-0.02mol/l的cacl2·2h2o，0.21ml-2.5mol/l的mgcl2·6h2o，10ml-5mol/l的nacl，0.02ml微量元素混合液，38.7ml去离子水)，0.1g葡萄糖；蓝白斑筛选培养基的组成为：①各取25ml葡萄糖-mops培养基置于两个250ml的三角瓶中，向一个三角瓶中加入0.00435gk2hpo4和x-pi(50ug/ml)成为限磷培养基；向另一个瓶中加入0.0866gk2hpo4和x-pi(50ug/ml)成为过磷培养基。向两种培养基中均加入vb1(1g/l)溶液0.05ml和无菌水75ml，过滤灭菌分装。②取250ml的三角瓶两个，分别加入去离子水150ml和琼脂5g，在121℃下高压灭菌30min，冷却至50℃以下，然后将过滤灭菌好的葡萄糖-mops培养基倒入，摇匀倒平板；微量元素混合液的组成为：0.09g(nh4)6mo7o24，0.62gh3bo3，0.18gcacl2，0.06gcuso4，0.40gmncl2，0.07gznso4，1000mlh2o。
(5)将初选菌株接种于合成废水培养基中，于30℃和150r/min的条件下恒温振荡培养24h后，经6000r/min离心15min，按总磷测定法测定上清液的磷含量，取吸磷率高于50％的菌株进行硝酸盐还原产气实验。其中合成废水培养基的组成为：葡萄糖0.4g，蛋白胨0.1g，酵母膏0.01g，ch3coona0.25g，nacl0.05g，k2hpo40.07g，mgso4·7h2o0.15g，nh4cl0.18g，h2o1000ml，ph7.2；硝酸盐还原产气培养基的组成为：3g牛肉膏，5g蛋白胨，1gkno3，1000mlh2o，ph7.2。
(6)经硝酸盐产气试验得到的能产气的菌株投入到富氮富磷培养基中，于30℃和150r/min条件下振荡培养24h后，进行离心，分别用钼锑抗分光光度法和麝香草酚分光光度法测定上清液中po43--p和no3--n含量的变化，最终得到一株高效的中温好氧反硝化脱氮除磷菌j16。富氮富磷培养基的组成为：3.32gch3coona·3h2o，152.8mgnh4cl，50mgk2hpo4，91.26mgmgso4·7h2o，25.68mgcacl2·2h2o，500mgkno3，8.5gpipes缓冲液，2ml微量元素，10mgnacl，1000mlh2o，ph7.2；微量元素溶液的组成为：63.7gna2edta，5.06gmncl2·4h2o，5.0gfeso4·7h2o，2.2gznso4，5.5gcacl2，1.1gna2moo4·4h2o，1.57gcuso4·5h2o，1.61gcocl2·6h2o，1000mlh2o，ph7.2。
本实施好氧反硝化脱氮除磷菌于2017年12月11日在中国微生物菌种保藏管委会普通微生物中心保藏，保藏编号为no.15044，该菌株16srdna的genbank登录号为mf667015。该菌革兰氏染色阴性，细胞为短杆状，细菌菌落呈圆形，大小为1-1.2mm，乳白色，表面光滑，边缘整齐，微隆起，有光泽，不透明，其最适生长条件为：ph7.2-8.0，温度30-35℃。
实施例2
中温好氧反硝化脱氮除磷菌降解水体中氮、磷的性能：
将驯化得到的高效降解菌株大肠埃希氏菌(escherichiacoli)j16在活化培养基中进行扩繁。取3ml菌悬液加入装有100ml富氮富磷合成废水的150ml三角瓶，于恒温培养箱中30℃、150r/min条件下培养，另外一瓶装有富氮富磷合成废水的150ml三角瓶中不接种大肠埃希氏菌(escherichiacoli)j16，作为非生物作用进行脱氮除磷的对照。设置3个平行样，所有操作均在无菌条件下进行。24h以后取样离心，分析上清液中氮、磷的残留量。结果表明，大肠埃希氏菌(escherichiacoli)j16对水环境中的氮、磷具有高效的降解性能，当po43--p和no3--n初始浓度分别为8.9mg/l和69.31mg/l时，24h后的脱氮除磷率分别达94.55％和96.03％。
实施例3
各生长因子对中温好氧反硝化脱氮除磷菌去除氮、磷效果的影响：
选取温度、ph、接种量及po43--p浓度作为影响因子，设置不同梯度的单因素实验。考查其对大肠埃希氏菌(escherichiacoli)j16脱氮除磷效能的影响。各因子的梯度分别设为ph6.0、7.2、7.5、8.0及9.0；温度20、25、30、35及40℃；接种量0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％以及5％；初始浓度po43--p分别为4.45、8.9、13.35、17.8及22.25mg/l。具体降解实验过程同实施例1。结果表明，在实验范围内，大肠埃希氏菌(escherichiacoli)j16进行脱氮除磷反应的适宜条件为ph7.2-8，温度30℃左右，接种量3％，初始浓度po43--p为8.9mg/l。
实施例4
菌株j16强化污泥脱氮除磷的应用：
将富氮富磷培养基作为模拟富营养化废水，并使其磷酸盐磷的含量为8.9mg/l，硝酸盐氮的含量为69.31mg/l。取适量活性污泥进行离心，用无菌蒸馏水洗涤后称量污泥湿重，按3％的量悬浮后转接至装有300ml无菌富氮富磷培养基的500ml锥形瓶中，于30℃，150r/min条件下振荡培养24h。按同样的方法量取适量的活化菌液和污泥混合液进行离心称重，使得菌株j16和污泥组成质量比为1:2，并用无菌水悬浮后转接至装有300ml无菌富氮富磷培养基的500ml锥形瓶中，于30℃，150r/min条件下振荡培养24h。采用钼酸铵分光光度法和麝香草酚分光光度法测定培养前后磷酸盐磷和硝酸盐氮含量的变化。结果表明，24h后，纯污泥的脱氮率可达63.77％，强化污泥的脱氮率可达79.69％，较纯污泥脱氮率高15.92％；纯污泥的除磷率可达81.21％，强化污泥的除磷率可达94.93％，较纯污泥除磷率提高了13.72％。本实例说明，菌株j16对污泥脱氮除磷具有很好的强化效果。