一种快速判定烟草种子采收时间的方法与流程

本发明属于种子繁殖生产技术领域，具体涉及一种快速判定烟草种子采收时间的方法。

背景技术：

种子活力是判断种子质量的一个重要指标。高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力，对提高种子耐藏性和田间成苗率、抵抗苗期逆境、节省播种量、增加产量具有重要意义。目前大量研究证明，种子的萌发率、活力指数等生理指标可以反映种子萌发速度、幼苗发育潜力和植株品质，能够成为判定种子活力高低的可信指标。种子萌发试验法比较直观、指标明确，但通常一次试验需要7-14天，耗时长、操作繁琐。由于在生化、分子方面的成熟机理尚未开展深入研究，缺乏烟草种子活力的内在评价指标，在实际生产中，烟草种子的活力仍然主要依靠萌发率来判断。

烟草种子的活力决定了烟草种子的采收时间。目前，在实际种子繁殖生产中，主要依据蒴果和种子颜色进行经验判断采收时间，这种方式无法准确反映种子的真实活力情况。在成熟过程中萌发率随时间变化非常快，尽管种子采收后可通过测定种子萌发率评价种子活力情况，然而这一检测过程需要耗时太长，无法实现及时判定采收时间。因此，需要建立一种可以快速测定种子活力，进而判定采收时间的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，我们对烟草种子成熟过程中种子活力同其内含物、酶活水平等进行了深入研究。研究表明：烟草种子在成熟过程中，种子中总超氧化物歧化酶水平同其活力有很强的相关性。据此，我们可以通过快速测定烟草种子成熟过程中的总超氧化物歧化酶的水平，评价种子的活力，进而判断种子的适宜采收时间。这一发明，可以将烟草种子活力判定缩短到半天的时间内，可以实际解决如何准确快速判定烟草种子采收时间的问题。

为实现本发明的上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种快速判定烟草种子采收时间的方法，包括以下步骤：

（1）种子剥取：采摘云烟87和msk-326蒴果，人工剥取种子；

（2）粗酶液提取：取大约0.1g种子于2ml离心管中，并加入0.9ml提取液，置于全自动样品快速研磨仪中研磨至匀浆，匀浆经过离心后取上清液用于抗氧化酶测试；

（3）总过氧化物歧化酶活性测定：采用羟胺法测定；

（4）判定：当总过氧化物歧化酶的测定值低于极限数值时，则判定可以进行采收，yy-87和msk-326种子中总过氧化物歧化酶的极限数值分别为75u/mgprot和90u/mgprot。

步骤（2）中，所述的提取液为50mm磷酸盐缓冲液，ph=7.4，离心条件为5000g，10分钟。

附图说明：

图1：不同成熟时期云烟87和msk-326的种子萌发率；

图2：不同成熟时期云烟87和msk-326的种子总过氧化物歧化酶的活性；

图3：烟草种子萌发率和总过氧化物歧化酶活性的相关性分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种快速判定烟草种子采收时间的方法，包括以下步骤：

（1）种子剥取：采摘云烟87和msk-326蒴果，人工剥取种子；

（2）粗酶液提取：取大约0.1g种子于2ml离心管中，并加入0.9ml提取液，置于全自动样品快速研磨仪中研磨至匀浆，匀浆经过离心后取上清液用于抗氧化酶测试；

（3）总过氧化物歧化酶活性测定：采用羟胺法测定；

（4）判定：当总过氧化物歧化酶的测定值低于极限数值时，则判定可以进行采收，yy-87和msk-326种子中总过氧化物歧化酶的极限数值分别为75u/mgprot和90u/mgprot。

步骤（2）中，所述的提取液为50mm磷酸盐缓冲液，ph=7.4;离心条件为5000g，10分钟。

实施例1

1.花粉采集及授粉

采集云烟87和msk-326含蕾期至花始开期的父本花朵，剥离花药，晒干使其散粉，用50目筛子筛出花粉，在4℃下干燥密封保存备用；在红花大金元、云烟87、msk-326和云烟97盛花期，摘取已开放花朵、蒴果，对其进行授粉，授粉结束后摘除幼嫩花蕾。

2.蒴果采摘及种子剥取与保存

摘取每个品种授粉后第14d、21d、23d、25d、27d、29d、31d、33d、35d的蒴果。采摘后的蒴果人工剥出种子后一部分用于进一步的萌发率实验，另一部分经液氮冷冻后放于-80℃保存，用于抗氧化酶活性检测。

3.种子萌发实验

在培养皿中垫2层湿润滤纸，每个培养皿均匀放置100粒种子，加盖。将种子置于光照培养箱内，25℃下每天光照12h发芽，发芽期间保持滤纸湿润。7天后统计种子的萌发率。计算公式为：萌发率（%）=7天种子萌发的数目/供试种子数×100%。萌发率实验表明随着烟草种子的不断成熟，其萌发率不断提高（图1）。

4.粗酶液提取及抗氧化酶测定

取大约0.1g种子于2ml离心管中，并加入0.9ml提取液（50mm磷酸盐缓冲液，ph=7.4），置于全自动样品快速研磨仪（上海净信科技，tissuelyser-48）中研磨至匀浆。匀浆经过离心（5000g，10min）后取上清液用于抗氧化酶测试。

采用分光光度法测定了烟草种子成熟过程中总过氧化物歧化酶的活性。结果表明随着种子的不断成熟，总过氧化物歧化酶活性不断降低（图2）。

5.相关性分析及种子采收的总过氧化物歧化酶活性判定

利用spss16.0对总过氧化物歧化酶活性与萌发率做相关分析，相关分析表明两者呈显著负相关，pearson相关系数均达到-9.80。结合萌发率的数据我们判定当yy-87和msk-326种子中总过氧化物歧化酶数值分别低于75u/mgprot和90u/mgprot时适合采收。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种快速判定烟草种子采收时间的方法。本发明提供的方法包括种子剥取、粗酶液提取、总过氧化物歧化酶活性测定和判定等步骤。当总过氧化物歧化酶的测定值低于极限数值时，则判定可以进行采收，YY‑87和MSK‑326种子中总过氧化物歧化酶的极限数值分别为75U/mg prot和90U/mg prot。本发明提供的方法条件选择合理，检测数据准确可靠，耗时短，能够在半天内完成所有检测步骤。弥补了现有的通过萌发率来判断烟草种子采收时间的方法所需时间过长的缺点，满足了烟草生产过程中的质量控制要求。

技术研发人员：牛永志;郑昀晔;马文广;古吉
受保护的技术使用者：玉溪中烟种子有限责任公司;云南省烟草农业科学研究院
技术研发日：2018.05.08
技术公布日：2018.11.20