一种具有防病和降解无机磷双重作用的枯草芽孢杆菌的制作方法

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种具有防病和降解无机磷双重作用的枯草芽孢杆菌，还涉及含有该枯草芽孢杆菌的微生物菌剂，以及它们的用途。
背景技术：
黄瓜白粉病是我国黄瓜生产上的主要病害之一，在北方温室及大棚中常见发生。该病害由棕丝单囊壳菌(sphaerothecafuliginea)引起，具有潜育期短、流行性强及再侵染频繁等特点。黄瓜白粉病主要影响黄瓜叶片的光合作用，造成早期果实生长缓慢及植株早衰，进而影响黄瓜后期生长，给黄瓜生产造成较大损失，一般年份因黄瓜白粉病而导致的黄瓜减产约为10％，发病严重时可引起20～40％的产量损失。目前，防治黄瓜白粉病的方法主要以化学防治为主，国内用于防治黄瓜白粉病的农药主要有氟硅唑、腈菌唑、氟菌唑或戊唑醇等单剂及各种复配剂。然而，长期大量使用农药，不仅造成农产品和环境污染，危害人畜安全，而且还会面临抗药性丧失，引发新病害或发生次生病害等问题。生物防治由于具有对环境友好、以及对人畜安全等优点，受到越来越多的关注。目前，用于防治黄瓜白粉病的微生物主要有：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis，cn106172507a)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis，cn102399712a)、黄麻链霉菌(streptomycescorchorusii，cn102870821a)和蕈状芽孢杆菌(bacillusmycoides，cn105002120a)等，但商品化的微生物制剂并不多。长期以来，人们通过大量施用化肥来达到提高农作物产量的目的。而磷肥施用至土壤中后很快就被固定生成无效态磷，植物难以吸收利用，同时造成了磷在土壤中的大量积累。利用微生物生命活动过程中所产生的酸降解难溶性无机磷(磷酸钙、磷灰石等)，是提高农作物生长有效磷水平的有效途径。目前，用于降解无机磷的芽孢杆菌主要有解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens，cn106399177a；cn106399178a)、阿氏芽孢杆菌(bacillusaryabhattai，cn106244496a)；枯草芽孢杆菌(cn105296381a；cn104263679a；伍善东等，江苏农业科学,2015,43(12):374-376；王玉琴等，微生物学通报,2015,42(1):101-109；张云霞等，江苏农业学报,2016,32(5):1073-1080)。上述芽孢杆菌功能单一，或只有防治黄瓜白粉病的能力，或只有降解无机磷的功能，其次，生防微生物是与病原菌相互进化的产物，也是环境的产物，随着病原菌的变化或者环境条件的变化，生防微生物的功能可能会丧失；同时，多样性的生防微生物亦可延缓病原菌产生抗性的时间，增强药效持久性，因此，不断筛选新的生防微生物，是应对病原菌生理小种或/和环境的变化的最经济有效的手段，是保证农业可持续发展的基础。技术实现要素：本发明目的在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有防止植物病害和降解无机磷的双重作用。本发明第二目的在于提供上述枯草芽孢杆菌的用途。本发明第三目的在于提供一种微生物菌剂。本发明第四目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂的用途。本发明第六目的在于提供一种以上述菌株为受体菌的基因工程菌。本发明第七目的在于提供用于鉴定上述枯草芽孢杆菌的分子标记。本发明通过以下技术方案实现：本发明一种枯草芽孢杆菌(acillussubtilis)菌株wkbs-26，其保藏编号为cgmccno.14953。上述菌株wkbs-26在防治植物病害上的应用。上述应用中所述的植物病害是指黄瓜白粉病(sphaerothecafuliginea)、番茄灰霉病(botrytiscinerea)、番茄早疫病(alternariasolani)、黄瓜靶斑病(corynesporacassiicola)或马铃薯晚疫病(phytophthorainfestans)等。优选为黄瓜白粉病(sphaerothecafuliginea)。上述菌株wkbs-26在降解无机磷上的应用。上述菌株wkbs-26在降解土壤无机磷上的应用。上述菌株wkbs-26在防治黄瓜白粉病和和降解土壤无机磷上的应用。本发明还提供了一种微生物菌剂，所述的微生物菌剂含有上述菌株wkbs-26。上述微生物菌剂，其剂型可以为液体制剂或固体制剂。上述微生物菌剂，其菌株wkbs-26的活菌数为50.0×106～50.0×108cfu/ml；或50.0×106～50.0×108cfu/g。上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株wkbs-26在lb平板培养基上活化，挑取单菌落在lb斜面培养基上25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)所得的活化菌株，然后接种到100mllb液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)所得的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(ph值为7.2)中，在温度为25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养36～40h，得发酵液；(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为wkbs-26的液体制剂。上述制备方法步骤(1)中所述lb平板培养基或lb斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000ml。上述制备方法步骤(2)中所述lb液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000ml。所述的lb平板培养基、lb斜面培养基和lb液体培养基均按照常规方法制备。上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，nacl0.1～1.0％，mnso4·h2o0.5～1.0％，其余为水。所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、nacl和mnso4·h2o混合，再加水，调节ph搅拌均匀即可。上述微生物菌剂在防治植物病害上的应用。上述应用中所述的植物病害是指黄瓜白粉病(sphaerothecafuliginea)、番茄灰霉病(botrytiscinerea)、番茄早疫病(alternariasolani)、黄瓜靶斑病(corynesporacassiicola)或马铃薯晚疫病(phytophthorainfestans)等。优选为黄瓜白粉病(sphaerothecafuliginea)。上述微生物菌剂在降解无机磷上的应用。上述微生物菌剂在降解土壤无机磷上的应用。上述微生物菌剂在防治黄瓜白粉病和和降解土壤无机磷上的应用。上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为107cfu/ml，于黄瓜白粉病发病前进行叶面喷雾即可。或待黄瓜子叶完全展开，刚露出第一片真叶时，将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为107cfu/ml进行灌根处理，每棵苗浇灌200ml，可到达降解土壤中的无机磷并促进黄瓜生长的目的。本发明还提供了以上述菌株wkbs-26为受体菌的基因工程菌；所述的基因工程菌提高了防治黄瓜白粉病等植物病害的效果、或提高了降解土壤无机磷的能力，或同时提高了防治黄瓜白粉病和降解无机磷的能力。用于鉴定上述菌株的分子标记，所述的分子标记由seqidno.2所示的核苷酸序列组成。本发明具有的优点和有益技术效果：(1)本发明枯草芽孢杆菌wkbs-26对黄瓜白粉病等植物病害防治效果好，平均防效在90.0％以上，为黄瓜白粉病的防治提供了一个新途径；(2)本发明枯草芽孢杆菌wkbs-26还具有良好的降解土壤无机磷能力，能显著提高土壤中无机磷的利用率，对减少磷肥施用量、促进作物生长、提高产量有重要作用；(3)本发明枯草芽孢杆菌wkbs-26是一种具有防病和降解无机磷双重作用的功能菌，可一菌多用，大大降低生产成本；(2)本发明菌株wkbs-26抑菌谱广，还对黄瓜白粉菌、番茄灰霉菌、番茄早疫菌、黄瓜靶斑菌和马铃薯晚疫菌等都有很好的抑制作用；(3)本发明wkbs-26菌株对黄瓜白粉病等植物病害专化性强，不易产生抗药性，药效持久性好；(4)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题；(5)本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低。生物保藏本发明枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株wkbs-26是本发明的发明人自行筛选得到，该菌株己于2017年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmccno.14953。附图说明图1.为根据16srdna序列获得的wkbs-26菌株系统发育树图。图2.为根据gyrb基因序列获得的wkbs-26菌株系统发育树图。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步解释和说明，但是不对本发明构成任何限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。实施例1本发明菌株wkbs-26的筛选过程和分类鉴定(一)筛选分离过程2015年9月在河北省保定市徐水县遂城镇城北庄村黄瓜田(黄瓜白粉病病田)五点采集土样，共采集5份土样，每份200g，混匀后称取1g放到250ml的灭菌三角瓶中，加入100ml无菌水，放到摇床上，在180r/min振荡30min，静置2h，取上清液10ml加入到50ml灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1ml加无菌水9ml，即成10ml10-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤微生物悬液稀释成10-4、10-5、10-6倍稀释液；取各浓度微生物悬液100μl涂于lb培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d～3d，进行细菌的分离和纯化。并以黄瓜白粉病为靶标，通过盆栽试验法进行生防菌的筛选，然后通过透明圈法、钼锑抗比色法进一步对所选生防菌的降解无机磷能力进行评价，结果从中筛选出一株既能防治黄瓜白粉病、又能降解无机磷的双重作用的菌株，定名为wkbs-26。(二)wkbs-26菌株的分类鉴定：(1)形态特征鉴定在lb培养基上培养，菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，膜状，圆形，培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断wkbs-26菌株属于芽孢杆菌属(bacillus)。(2)利用16srdna序列进行分类鉴定以wkbs-26菌株的基因组dna为模板，以通用引物f27和r1492为引物进行pcr扩增，所述引物为：f27：5’-agagtttgatcatggctcag-3’；r1492：5’-ggctaccttgttacgactt-3’。其中pcr的反应体系(50μl)为：10×pcrbuffer(mg2+)5μl，dntpmixture(2.5mm)5μl，taq(5u/μl)1μl，f27(10μmol/l)1μl，r1492(10μmol/l)1μl，wkbs-26的基因组dna50ng，ddh2o补足至50μl。pcr的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得pcr扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得wkbs-26菌株的16srdna序列(见seqidno:1)。将所得16srdna序列在genbank中进行同源性比较，结果发现菌株wkbs-26与芽孢杆菌属的16srdna同源性达到99％；同时利用mega软件构建系统发育树，结果(见图1)wkbs-26与芽孢杆菌聚合到一起，说明wkbs-26属于芽孢杆菌属(bacillus)。(3)利用gyrb基因序列鉴定分类以wkbs-26菌株的基因组dna为模板，以芽孢杆菌gyrb基因简并引物gyrb-f和gyrb-r为引物进行pcr扩增，得pcr扩增产物；其中所述的引物序列为：gyrb-f：5’-ttgrcgghrgygghtataaagt-3’；gyrb-r：5’-tccdccstcagartcwccctc-3’。gyrb的pcr扩增反应体系(50μl)为:10×pcrbuffer(mg2+)5μl，dntpmixture(2.5mm)5μl，taq(5u/μl)1μl，gyrb-f(10μmol/l)1μl，gyrb-r(10μmol/l)1μl，wkbs-26基因组dna50ng，ddh2o补足至50μl。pcr的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得wkbs-26菌株的gyrb基因序列(见seqidno:2)。将wkbs-26菌株的gyrb基因序列在genbank中进行同源性比较，结果发现wkbs-26与枯草芽孢杆菌的gyrb基因序列同源性最高，达到99％；同时利用mega软件构建系统发育树，结果(见图2)wkbs-26菌株与枯草芽孢杆菌聚合到一起，说明wkbs-26为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，并且是一个新菌株。综合以上形态特征、16srdna和gyrb基因序列同源性对比分析的结果，可知wkbs-26属于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，并且和现有的枯草芽孢杆菌菌株不同，是一种新的枯草芽孢杆菌菌株。实施例2本发明wkbs-26微生物菌剂的制备按照如下步骤进行：(1)菌种活化：将保存于-80℃的枯草芽孢杆菌菌株wkbs-26(该菌株的保藏编号为cgmccno.14953)在lb平板培养基上进行活化(30℃)，挑取单菌落在lb斜面培养基上在30℃下培养12小时，得活化的菌株；其中lb平板培养基或lb斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000ml。(2)种子液的制备：在250ml三角瓶中装入100mllb液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000ml)，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化好的菌株，在30℃、摇床转速180rpm的条件下振荡培养12小时，得种子液；(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉2.5％，黄豆粉2.5％，nacl0.6％，mnso4·h2o0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500ml三角瓶中，每瓶200ml；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；(4)发酵培养：向步骤(3)所得的每瓶玉米粉黄豆粉培养基200ml中接种步骤(2)所得种子液2ml；在30℃、摇床转速180rpm条件下发酵培养36小时，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率(芽孢率的计算公式为：芽孢率(％)＝成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)×100)；芽孢率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养48小时，得wkbs-26液体制剂。采用平板菌落计数法测定，所得wkbs-26液体制剂的活菌含量为52.6×108cfu/ml。实施例3本发明菌株wkbs-26对黄瓜子叶的黄瓜白粉病防效对比试验(一)试验材料：(1)黄瓜品种：津春4号(天津黄瓜研究所)(2)黄瓜白粉病病原菌(sphaerothecafuliginea)sf-12，初始菌株来自河北省农林科学院植物保护研究所，接种用sf-12分生孢子悬浮液由初始菌株在保定微控生物科技有限公司人工气候室扩繁得来。(二)试验处理：(1)wkbs-26液体制剂：实施例2制备的wkbs-26液体制剂的100倍水稀释液。(2)空白对照：清水。(三)试验方法：本试验于2016年1月在室内进行。在直径6cm的营养钵中培育津春4号黄瓜苗，育苗基质为蛭石，每个营养钵播种2粒种子，出苗后留取一棵壮苗。待黄瓜苗子叶完全展平后开展试验。试验设2个处理，处理为在黄瓜子叶上喷施实施例2制备的wkbs-26液体制剂100倍水稀释液，空白对照为喷施等量清水；重复4次，每个重复24株黄瓜苗。在25℃条件下保湿24h，然后喷雾接种sf-12的分生孢子悬浮液(1×105个/ml)，于25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。待空白对照子叶充分发病后，调查黄瓜子叶白粉病病情并计算病情指数和防效。调查方法、分级标准和防治效果计算方法参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则(一)杀菌剂防治黄瓜白粉病(gb/t17980.30-2000)(以下实施例与此相同)。表1本发明wkbs-26液体制剂对黄瓜子叶上的黄瓜白粉病防效对比试验结果处理病情指数防效(％)wkbs-26液体制剂5.64b92.81空白对照78.49a/结果(见表1)经wkbs-26液体制剂处理的黄瓜子叶的病情指数仅为5.64，显著低于空白对照的病情指数78.49，wkbs-26液体制剂对黄瓜白粉病的防效为92.81％。说明本发明wkbs-26菌株及其液体制剂对黄瓜白粉病具有突出的防治效果。实施例4本发明wkbs-26液体制剂对黄瓜真叶的黄瓜白粉病防效试验按照如下方法进行:本试验于2016年4月在保定微控生物科技有限公司人工气候室内进行。在直径6cm的营养钵中培育津春4号黄瓜苗，育苗基质为蛭石，每个营养钵播种2粒种子，出苗后留取一棵壮苗。待黄瓜生长出两片真叶时移栽到直径12cm的塑料花盆中(所用土壤配比为田园土:蛭石＝1:1)，在25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。待黄瓜长出5-6片真叶后开展试验。处理为喷施实施例2制备的wkbs-26液体制剂100倍水稀释液；空白对照为喷施等量清水。重复4次，每个重复4盆黄瓜苗。在25℃条件下保湿24h；然后喷雾接种sf-12分生孢子悬浮液(1×105个/ml)，继续于25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。待空白对照真叶充分发病后，调查黄瓜真叶白粉病病情并计算病情指数和防效。结果(见表2)经wkbs-26液体制剂处理的黄瓜真叶的病情指数为5.85，显著低于空白对照的病情指数89.57，其对黄瓜白粉病的防效为93.47％。说明wkbs-26菌株及其液体制剂对黄瓜白粉病具有突出的防治效果。表2wkbs-26液体制剂对黄瓜真叶上的黄瓜白粉病防效试验结果处理病情指数防效(％)wkbs-26液体制剂5.85b93.47空白对照89.57a/实施例5wkbs-26液体制剂对黄瓜白粉病防效田间试验按照如下方法进行：本试验于2017年春季在河北省保定市定兴县东落堡乡东册村黄瓜大棚内开展。翻地、施肥、播种、浇水同当地农事操作。试验设置3个处理，处理1为喷施实施例2制备的wkbs-26液体制剂100倍水稀释液；处理2为化学药剂，喷施10％苯醚甲环唑水分散粒剂(瑞士先正达作物保护有限公司生产)800倍水稀释液；空白对照为喷施等量清水；重复4次，每个重复3行，每行约20棵黄瓜苗。在黄瓜白粉病发病之前开始试验，间隔5-7d天处理一次，直到空白对照充分发病，调查黄瓜白粉病病情并计算病情指数和防效。结果(见表3)经wkbs-26液体制剂处理的病情指数为7.42，显著低于空白对照的病情指数78.94，其对黄瓜白粉病的防效达90.54％，优于化学药剂的防治效果87.89％。说明本发明wkbs-26菌株及其液体制剂对黄瓜白粉病具有突出的防治效果。表3wkbs-26液体制剂对黄瓜白粉病防效试验结果处理病情指数防效(％)wkbs-26液体制剂7.42bc90.54化学药剂9.56b87.89空白对照78.94a/实施例6本发明wkbs-26菌株降解无机磷能力定性测定试验按照如下方法进行：用灭菌牙签将实施例2步骤(1)中活化好的wkbs-26菌株点接接种在解无机磷平板培养基(该培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖10.0g，(nh4)2so40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.2g，ca3(po4)25.0g，kcl0.2g，mnso40.03g，feso40.003g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，ph：7.0-8.0)上，置于30℃恒温培养箱培养5天，测量透明圈直径及菌落的直径。结果wkbs-26菌株在含有ca3(po4)2的无机磷平板培养基上产生直径11.8毫米的透明圈，说明本发明菌株wkbs-26能够很好降解无机磷ca3(po4)2，具有降解土壤中无机磷的潜力。实施例7wkbs-26菌株降解无机磷能力定量测定试验按照如下方法进行：(1)发酵培养基制备：按照比例将葡萄糖10.0g，(nh4)2so40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.2g，ca3(po4)25.0g，kcl0.2g，mnso40.03g，feso40.003g加入到蒸馏水1000ml中，混合均匀，即得发酵培养基(ph：7.0-8.0)。将发酵培养基100ml装入300ml锥形瓶中，高温高压灭菌，待用。(2)发酵液制备：将实施例2步骤(2)所得的wkbs-26菌株种子液和空白对照培养液(不接种wkbs-26菌株的lb液体培养基)分别按照重量百分比为2％的比例接种到步骤(1)制备的发酵培养基中，每组3个重复，在30℃、180r/min培养6d，得发酵液。(3)发酵液处理：将培养好的发酵液转移至无菌的离心杯中，采用kq5200de型数控超生波清洗器进行超声波细胞破碎，破碎条件：200-240v，2a，50/60hz，时间20min。使之释放出细胞内的有效磷。以8000r/min的转速离心10min后取2.5ml上清液于50ml比色管中，加2滴2，4-二硝基苯酚作指示剂，用10％naoh和5％稀硫酸溶液调节ph值至溶液刚呈微黄色，加钼锑抗显色剂5ml，定容，反应30min后。用t6新世纪紫外可见分光光度计测定上清液在720nm处的od值。根据标准曲线计算上清液中的有效磷含量。(4)结果计算：由样品溶液比色所得吸收值在工作曲线上算出相应的比色溶液的含磷量(mg/l)，再按下式计算发酵液中有效磷含量：有效磷(mg/l)＝比色液的磷(mg/l)×稀释倍数。结果(见表4)接种wkbs-26菌株的发酵培养液中可溶性磷含量与空白对照相比增加到77.41mg/l，表明本发明wkbs-26菌株具有降解无机磷磷酸三钙的效果好。表4本发明菌株wkbs-26降解无机磷能力定量测定试验结果菌株编号od720(nm)可溶性磷含量(mg/l)wkbs-261.52877.41空白对照0.20210.25实施例8本发明wkbs-26菌株对黄瓜植株的促进生长作用试验(一)试验材料：(1)基质：沙子+底物其中：沙子预先用水冲洗3遍，风干备用，ph：6.0左右；底物：磷酸三钙，1g/kg基质。(二)试验方法：本试验于2017年6月上旬在保定微控生物科技有限公司人工气候室内进行。首先培育津春4号黄瓜苗，待其长出2片真叶后选取长势一致的黄瓜幼苗移栽于装有3.5kg沙子的花盆中(高：20cm、盆口直径：22cm、盆底直径：15cm)，每盆3株黄瓜苗，置于人工气候室中培养，缓苗后开始试验。试验设置处理和对照，处理为浇灌250ml实施例2制备的wkbs-26发酵液的稀释液(浓度为1×107cfu/ml)于黄瓜根部，对照为浇灌等量的实施例2步骤(3)制备的发酵培养基水稀释液。重复3次，每个重复处理1盆。期间常规管理，适时补充水分，每次400ml/盆。每5d浇一次缺磷营养液(缺磷营养液的组成成分见专利申请201110107663x)，每次250ml/盆。30d后测定黄瓜的株高、地上部鲜重和地下部鲜重、基质中的有效磷以及黄瓜植株体内磷含量等指标。结果(见表5)接种菌株wkbs-26发酵液处理的黄瓜株高、地上部鲜重、地下部鲜重均与对照之间存在显著差异，株高增长率为28.21％，地上部鲜重增长率为22.59％，地下部鲜重增长率为113.06％。说明wkbs-26菌株及其微生物菌剂对黄瓜植株促生长效果显著。从表6中可以看出，经wkbs-26菌株处理后土壤中有效磷增长率为50.88％；菌株wkbs-26处理后的黄瓜植株中有效磷增长率为20.45％。说明本发明wkbs-26菌株能够有效降解土壤中的无机磷，并促进黄瓜植株对降解后的有效磷的吸收。表5本发明wkbs-26菌株促进黄瓜生长试验结果表6本发明wkbs-26菌株对基质或黄瓜植株有效磷的影响试验结果实施例9本发明菌株wkbs-26对不同植物病害病原菌的抑制作用试验(一)供试病原菌菌株(1)番茄灰霉菌bc-14：分离自河北省保定市徐水县高林村镇白塔铺村番茄病果，经河北农业大学鉴定为灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)(2)番茄早疫病菌as-8：分离自河北省保定市徐水县高林村镇白塔铺村番茄病果，经河北农业大学鉴定为茄链格孢菌(alternarisolani)(3)黄瓜靶斑病菌cc-6：分离自保定市定兴县东落堡乡东册村黄瓜病株，经河北农业大学鉴定为多主棒孢霉(corynesporacassiicola)。(4)马铃薯晚疫病菌pi-2：分离自张家口市尚义县甲石河乡西杨木沟村马铃薯病块茎，经河北农业大学鉴定为致病疫霉(phytophthorainfestans)。以上四个菌株致病力测定表现为强致病力。(二)试验方法：本试验于2017年6月上旬在保定微控生物科技有限公司实验室内进行。首先将供试病原菌在pda平板上活化培养4天，然后用打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌盘，接着将菌盘转接在另一个pda平板中央，再将实施例2步骤(1)活化后的枯草芽孢杆菌wkbs-26点接在距指示菌菌盘2.0厘米处，设空白对照(不点接wkbs-26菌株)。在25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种wkbs-26后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。抑菌率的计算公式为：抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。结果(见表7)，枯草芽孢杆菌wkbs-26对番茄灰霉菌的抑制率为68.25％，对番茄早疫菌的抑制率为67.50％，对黄瓜靶斑菌的抑制率为65.00％，对马铃薯晚疫菌的抑制率为70.26％，说明枯草芽孢杆菌wkbs-26对这四种病原菌具有明显的抑制作用，具有防治番茄灰霉病、番茄早疫病、黄瓜靶斑病及马铃薯晚疫病的生防潜力。表7本发明菌株wkbs-26对四种病原菌的抑制作用试验结果病原菌正常生长(mm)抑制生长(mm)抑菌率(％)番茄灰霉菌(b.cinerea)bc-144012.768.25番茄早疫菌(a.solani)as-83210.467.50黄瓜靶斑菌(c.cassiicola)cc-63010.266.00马铃薯晚疫菌(p.infestans)pi-23811.370.26序列表<110>保定微控生物科技有限公司<120>一种具有防病和降解无机磷双重作用的枯草芽孢杆菌<130>2018s1239inh<141>2018-06-15<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1483<212>dna<213>bacillussubtilis<400>1ggcgtgcctaatacatgctagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcg60gcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaac120cggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaacggtggcttcgg180ctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaa240ggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcc300cagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggag360caacgccgcgtgagtgatgaaggatttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaaca420agtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaacta480cgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaa540agggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaacctgggagggt600cattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtg660aaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactga720cgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgt780aaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcatta840agcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgtaactcaaaggaattgacgggggccc900gcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtctt960gacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggt1020gcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaac1080ccttgatcttagttgacagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaacc1140ggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtg1200ctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagcctatcccacaaatctg1260ttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcg1320cggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacacca1380cgagagtttgtaacacccgtagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggt1440gggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatc1483<210>2<211>1190<212>dna<213>bacillussubtilis<400>2atttgacggaagcggctataaagtatccggaggattacacggtgtaggtgcgtcggtcgt60aaacgcactatcagcagagcttgatgtgacggttcaccgtgacggtaaaattcaccgcca120aacctataaacgcggagttccggttacagaccttgaaatcattggcgaaacggatcatac180aggaacgacgacacattttgtcccggaccctgaaattttctcagaaacaaccgagtatga240ttacgatctgcttgccaaccgcgtgcgtgaattagcctttttatcaaagggcgtaaacat300cacgattgaagataaacgtgaaggacaagagcgcaaaaatgaataccattacgaaggcgg360aattaaaagttatgtagagtatttaaaccgctctaaagaggttgtccataaagagccgat420ttacattgaaggcgaaaaggacggcattacggttgaagtggctttgcaatacaatgacag480ctacacaagcaacatttactcgtttacaaacaacattaacacgtacgaaggcggtaccca540tgaagctggcttcaaaacgggcctgactcgtgttatcaacgattacgccagaaaaaaagg600gcttattaaagaaaatgatccaaacctaagcggagacgacgtaagggaagggctgacagc660gattatttcaatcaaacaccctgatccgcagtttgagggccaaacaaaaacaaagctggg720caactcagaagcacggacgatcaccgatacgttattttctacggcgatggaaacatttat780gctggaaaatccagatgcagccaaaaaaattgtcgataaaggtttaatggcggcaagagc840aagaatggttgcgaaaaaagcgcgtgaactaacacgccgtaagagtgctttggaaatttc900aaacctgcccggtaagttagcggactgctcttcaaaagatccgagcatctccgagttata960tatcgtagagggtgactctgccggaggatctgctaaacaaggacgcgacagacatttcca1020agccattttgccgcttagcggtaaaatcctaaacgttgaaaaggccagactggataaaat1080cctttctaacaacgaagttcgctctatgatcacagcgctcggcacaggtatcggagaaga1140cttcaaccttgagaaagcccgttaccacaaagttgtcattatgacagatg1190当前第1页12