一株芽孢杆菌及其在制备微生物种子包衣中的应用的制作方法

本发明涉及一株细菌及其应用，具体涉及一株芽孢杆菌及其在制备微生物种子包衣中的应用，属于生物
技术领域：
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背景技术：
溶磷菌(phosphate-solubilizingmicroorganism,psm)是土壤中一种特殊的微生物类群，能够将植物难以吸收利用的无效磷转化为可吸收利用的有效磷形态的一类特殊微生物功能的菌群，其在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用。溶磷菌可通过分泌各种酶类或有机酸来活化土壤中的难溶态磷，影响植物根系分泌物，促进植物根系对k、n、ca、mg、fe、zn等营养元素的吸收，促进植物的生长发育，影响根际微生物的群落结构。芽孢杆菌是溶磷微生物中重要的一类微生物，具有抗逆性强、营养简单、繁殖速度快、有效活菌数量高、性能稳定、储存期长等优势。并且某些菌种还具有防病、促生、溶磷、溶钾、固氮作用，对于发展生态农业，具有重要的现实意义。目前，溶磷菌多从土壤或者根系土壤中分离筛选所得，主要以菌肥的形式作为微生物菌剂应用，未曾有溶磷菌和种衣剂复配使用的报道。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一株芽孢杆菌。本发明的第二个目的在于提供该株芽孢杆菌在微生物种子包衣以及土壤解磷中的应用。为达到上述第一个目的，本发明所采用的技术方案如下：一株芽孢杆菌，分类命名为巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.15775，保藏日期为2018年5月21日。于2017年7月5日采集的安徽宿州市萧县(34°11′53.10″，116°58′50.53″)的向日葵根部土壤中分离得到本发明所涉及的芽孢杆菌mn213230；采用稀释平板法和平板涂布法将样品涂板于有机磷固体培养基上进行分离筛选。利用引物27f(5'-agagtttgatcmtggctcag-3')和1492r(5'-tacggytaccttgttacgactt-3')对菌株mn213230进行扩增和测序，得到序列长度为1405bp，菌株mn213230的16srdna序列如序列表所示。通过blast将序列与genbank数据库中序列进行对比，其与bacillusmegaterium的相似性为100，鉴定其为巨大芽孢杆菌bacillusmegaterium。为达到上述第二个目的，本发明所采用的技术方案如下：上述的芽孢杆菌在土壤解磷中的应用。上述的芽孢杆菌制成微生物种子包衣剂使用。进一步地，微生物种子包衣剂的制备方法为：将芽孢杆菌、粘合剂、成膜剂和纯净水四者混合均匀，即得。更进一步地，微生物种子包衣剂中活菌的数量为1×104cfu/ml～1×108cfu/ml。更进一步地，所述粘合剂为聚乙烯吡咯烷酮。更进一步地，所述成膜剂为聚乙二醇。有益效果：本发明将该株芽孢杆菌运用到微生物种子包衣，并用于溶磷。本发明中的巨大芽孢杆菌，不仅耐酸碱，还能降低培养基及土壤的ph值，而且能很好的降解土壤中不能被植物利用的磷，提高土壤肥力，促进植物根系的发育，提高植物对养分的吸收、促进植物的生长。附图说明图1为本发明的芽孢杆菌的革兰氏染色图图2为本发明的芽孢杆菌在有机磷固体培养基上的解磷圈三次重复效果图。图3为本发明的芽孢杆菌在lb固体培养基上的形态图。图4为本发明的芽孢杆菌应用于玉米包衣后对玉米的生长影响图，其中a为对照组(ck)，b为实验组。具体实施方式：下面结合附图对本发明的具体实施方式详细说明。1、分离及鉴定部分本发明的巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)mn213230分离于2017年7月5日采集的安徽宿州市萧县(34°11′53.10″，116°58′50.53″)的向日葵根部土壤。采用稀释平板法和平板涂布法将样品涂板于有机磷固体培养基(葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，酵母浸粉0.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，feso40.03g，mnso40.03g，ca3(po4)21g，mgso40.3g，卵磷脂0.2g，琼脂15-20g，水1l，ph7)上进行分离筛选获得，显微镜观察形态如图1所示。分离方法为：称取5g样品土壤于50ml无菌离心管中，加入45ml无菌水，涡旋振荡2～3min，使土壤颗粒均匀分散于无菌水中，得到稀释10倍(10-1)的土壤悬浮液，室温放置25min。吸取5ml悬浮液(吸取前要混匀)于装有45ml灭菌水的离心管中，得到稀释10-2的悬浮液，将得到的10-2的土壤悬浮液充分摇匀，如上继续稀释到10-3-10-5,取其10-3，10-4，10-5进行平板涂布，每个梯度涂布三个平行，28℃，2-4d，观察平板是否有出现解磷圈，挑选出有解磷圈的菌株保存，进行下一步复筛工作。菌株mn213230已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.15775，保藏日期为2018年5月21日。具有如下微生物学特性：在lb固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，水1l，ph7)平板上生长24h后，菌落圆形，乳白色，表面平整湿润(见图3)。利用引物27f(5'-agagtttgatcmtggctcag-3')和1492r(5'-tacggytaccttgttacgactt-3')对菌株mn213230进行扩增和测序，得到序列长度为1405bp，菌株mn213230的16srdna序列如序列表所示。通过blast将序列与genbank数据库中序列进行对比，其与bacillusmegaterium的相似性为100，鉴定其为巨大芽孢杆菌bacillusmegaterium。2、菌株mn213230的溶磷效果测定实验一固体平板测定菌株mn213230接种于解有机磷的固体平板上，各三个重复，28℃，5d后观察解磷圈，并记录好解磷圈(d)与菌落直径(d)，计算d/d值，检测菌株在固体培养基中的菌落直径及对固体平板难溶性磷的溶解能力。菌株mn213230的菌落直径为9.3mm，解磷圈直径为14mm，d/d的比值为1.5，结果如图2所示。实验二土壤实验接种液：将活化好的解磷菌芽孢杆菌mn213230接种到装有100ml的lb液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1l，ph7)的250ml三角瓶中，30℃180r/min振荡培养24h作为种子液，再将种子液稀释到有效活菌数约1×108cfu/ml获得接种液。土壤中按质量比加入加0.5％的磷酸钙，混匀后，用250ml的三角瓶各装100g混有磷酸钙的土壤，再分别加20ml纯净水水封好，采用湿热灭菌法，121℃灭菌60min。实验组每瓶加入接种液5ml，对照组(ck)则加入5ml灭菌的lb液体培养基，每个处理3个重复，接种后置于28℃培养箱中，于42d取样测定土壤有效磷。检测有效磷含量(采用ny/t1121.7-2014标准测定土壤有效磷)。具体数据如下：ck实验组重复116.9228.98重复218.6028.29重复315.2428.29均值16.9128.30结果显示：对照组的有效磷含量的平均值为16.91mg/kg，实验组的有效磷含量的平均值为28.30mg/kg，实验组比对照组增加了67.24％的有效磷含量。3、菌株mn213230的耐酸碱性效果测定ph值梯度培养基配置：以lb液体培养基为基础培养基，向其中加naoh或hcl溶液调节其ph值，ph值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的一系列lb培养基，在121℃灭菌25min后冷却备用。将溶磷菌mn213230接种于100ml不同ph值梯度的lb培养基中，接种菌液浓度为108cfu/ml，接种量为100ul，每个梯度设置3个重复，接种后，在28℃的恒温振荡器中180r/min，振荡48h，查看菌株的生长情况。结果显示：菌株mn213230有一定的耐酸碱能力，能在ph值为5-10之间生长。4、芽孢杆菌mn213230在促进植物根系发育中的应用种子处理：将菌数约1×108cfu/ml的mn213230的菌液与一定量的粘合剂(聚乙烯吡咯烷酮)、成膜剂(聚乙二醇)配置成简易种衣剂(10％的菌液，5％的成膜剂，2％的粘合剂，其他的为纯净水)，再将该简易种衣剂与大小、质地差不多的玉米种子以1：30的重量比进行混合包衣，使菌株能够均匀吸附于种子上，种子上有1×104cfu/ml～1×108cfu/ml的菌数。将3kg的灭菌土(土壤过10目筛，121℃，灭菌1h，加0.5％的磷酸三钙)装在32孔的育苗盘里。以有菌的种子为实验组，以无菌的种子为对照组(ck)，每个处理16个重复进行盆栽实验，常规管理。生长20d后收获，测定单个植株株高、茎长、根重及干重；并收集土样，进行土壤的ph值(采用ny/t1121.2-2006标准测定土壤ph值)及有效磷含量测试。盆栽实验结果：从数据可知，实验组的玉米生物量均明显的高于对照组(ck)的玉米(玉米的盆栽实验的对照图如图4)，特别是根系，实验组的根系比对照(ck)组鲜重上增加了23.39％，干重增加了15.04％。实验组的土壤有效磷比对照组的有效磷增加了4.4mg/kg，ph值下降了0.52，详细结果见表1、表2。表1和表2中，表中a、b字母不同表示处理之间差异显著，字母相同表示没有差异。表1菌株mn213230和玉米拌种对玉米苗期生长的生物量影响表2土壤中的有效磷和土壤ph值的变化由此可知，菌株mn213230能很好的促进植物根系的发育，提高植物的营养吸收，促进植物生长；降低土壤ph值，降解土壤无效磷，提高土壤有效磷含量，提高土壤肥力。菌株mn213230包衣玉米对玉米苗期生长的生物量影响见下表。上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属
技术领域：
普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。序列表<110>广州菌落生物科技有限公司<120>一株芽孢杆菌及其在制备微生物种子包衣中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1405<212>dna<213>巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)<400>1actgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaa60cctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttct120ccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtg180cattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagag240ggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagg300gaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggcttt360cgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgctcgtaccttg420acggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagg480tggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctg540atgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcag600aagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacacca660gtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaa720acaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggt780ttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgca840agactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat900tcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagataga960gcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgt1020gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttag1080ttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaat1140catcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgc1200aagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaa1260ctcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacg1320ttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcgg1380tggagtaaccgtaaggagctagccg1405当前第1页12