中华根瘤固氮菌株系H6及其应用的制作方法

本发明涉及一种中华根瘤固氮菌株系h6(sinorhizobiumsp.)及其应用。

背景技术

自然界中存在一些微生物能将空气中的氮气还原为氨，为微生物和植物提供氮源，这种现象被称为生物固氮。根据高等植物与固氮微生物之间的关系，将生物固氮分为自身固氮、共生固氮、联合固氮三个体系。

根瘤菌是一类革兰氏阴性无芽孢的土壤杆菌，能够与豆科植物苜蓿形成互利互惠的共生关系。这种共生关系具有固氮量大、抗逆性能力强等特点。

紫花苜蓿是家畜的优质牧草，在全球种植面积广泛，有“现金作物”之称，在土壤生态保护和农业生产中有着不可或缺的重要地位。新疆地处中国西北边陲，独特的气候条件适宜苜蓿生长，但新疆土壤的盐渍化严重影响苜蓿产量的提高。因此，提高苜蓿耐盐能力对于发展新疆的苜蓿产业有重要意义。同时很多研究表明，接种根瘤菌可提高苜蓿耐盐性，为了缓解苜蓿盐害，必须选育耐盐的根瘤菌适应盐渍化土壤，这样才能获得高产。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种中华根瘤固氮菌株系h6及其应用，所述的中华根瘤固氮菌株系h6于2018年5月7保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其简称为cctcc，保藏编号为cctccno:m2018255。该根瘤固氮菌株系h6是通过苜蓿植株捕捉土壤中的根瘤菌，从新鲜根瘤中对根瘤菌进行分离和纯化所得，并对菌株的16srdna部分序列进行测定，通过系统发育分析，确定为中华根瘤菌属(sinorhizobium)的新菌株系，并命名为h6。本发明所述的根瘤固氮菌株系h6通过砂培回接试验证明：其具有缓解苜蓿盐害，高效固氮的特性，盐处理条件下，接种该根瘤菌能够增加苜蓿生物量，提高植株体内氮、磷、钾含量，可适用于新疆等盐渍化地区，作为苜蓿常规栽培的措施之一。

本发明所述的一种中华根瘤固氮菌株系h6，该中华根瘤菌h6sinorhizobiumsp.h6属于中华根瘤菌属，于2018年05月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctccno:m2018255。

所述的中华根瘤固氮菌株系h6在制备豆科植物共生固氮及缓解盐害中的应用。

本发明所述的中华根瘤固氮菌株系h6于2018年5月7保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其简称为cctcc，保藏编号为cctccno:m2018255，地址：中国武汉，武汉大学，于2016年7月在新疆农业大学三坪实验农场种植的苜蓿根瘤中分离出来的。

所述中华根瘤固氮菌株系h6的特点为：

一、中华根瘤固氮菌株系h6的分离：

1)取新鲜根瘤，用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；

2)放入体积浓度为95％的酒精中处理3分钟，取出，用无菌水冲洗5-6次，再放入体积浓度为0.2％hgcl2灭菌5分钟，取出，再用无菌水冲洗5-6次；

3)再将新鲜根瘤在火焰灭过菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向yma培养基表面划线，yma培养基的配方如表1所示，倒置后在温度28℃下黑暗培养；

表1yma(yeastmannitolagar)培养基配方(/l)

4)待长出菌体后，根据菌落形态和菌体形态两个方面初步判断是否为根瘤菌：

菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少，培养3-5天菌落直径达2-4mm为快生型根瘤菌，培养7-10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌；

菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察，内常含β-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(g-)，无芽孢，菌体单个或成对；

5)根据菌落形态和菌体形态两个方面，用接种环从培养基上挑选优势菌落继续在新的yma培养基上划线培养，3天后观察菌落情况；

二、中华根瘤固氮菌株系h6的性质：

形态特征：本菌株在菌落形态上，圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多，在yma平板上生长3天后的直径为0.8-2.0mm；

培养特性：该菌的最适生长条件为：温度28℃，转速200r/min；能够利用广泛的碳源和氮源；

生理特性：经革兰氏染色反应镜检均为g^-，呈小短杆状；

功能特性：根瘤菌h6具有固氮量大、耐盐性强等特点，当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤中根瘤菌的群体丰度，对豆科植物的结瘤固氮缓解盐害有明显作用；

三、中华根瘤固氮菌株系h6的16srdna序列测序：

为了鉴定根瘤菌的系统发育地位，对所分离的菌株16srdna序列进行测序，首先提取菌株的总dna，然后进行pcr特异性扩增，pcr扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检验后，用于序列测定，测序结果如seqidno:1所示：

根瘤菌(sinorhizobium)

>h6

从genbank数据库中获取参比菌株，应用软件mega对分离菌株和参比菌株的16srdna部分序列进行了分析，构建了分离菌株与标准菌株的系统发育关系图，得到反映待测苜蓿根瘤菌株与参比菌株之间进化与发育关系的系统发育树，从而确定分离出来的根瘤菌h6为中华根瘤菌属(sinorhizobium)的新菌株。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所述的中华根瘤固氮菌株系h6具有耐盐性特性，接种该根瘤菌能够提高苜蓿生物量，可用于实际生产；

通过接种本发明的中华根瘤固氮菌株系h6，能达到改善苜蓿氮营养，缓解盐害，从而达到苜蓿高产并且培肥土壤的目的；

本发明所述的中华根瘤固氮菌株系h6适用于新疆盐渍化土壤地区，作为苜蓿常规栽培的措施之一。

附图说明

图1为本发明中华根瘤固氮菌株系h6分离和在yma培养基上的菌落形态；

图2为发明中华根瘤固氮菌株系h6经革兰氏染色后在显微镜下的观察图像；

图3为本发明中华根瘤固氮菌株系h6的16srdna部分序列分析系统发育树状图；

图4为本发明接种中华根瘤固氮菌株系h6对生物量影响图，将接种标准菌株usda1002(1002)，h6，以及不接种的苜蓿品种中苜三号(zm)和阿尔冈金(gj)植株生长两周，加入不同浓度nacl的盐处理营养液(0和100mmnacl)，每三天浇一次，并在处理后两周收获，图中的数据是具有标准误差的四个生物学重复的平均值；

图5为本发明接种中华根瘤固氮菌株系h6对植株地上部、根部氮含量影响图，将接种标准菌株usda1002(1002)，h6，以及不接种的苜蓿品种中苜三号(zm)和阿尔冈金(gj)植株生长两周，加入不同nacl浓度的盐处理营养液(0和100mmnacl)，每三天浇一次，并在处理后两周收获，图中的数据是具有标准误差的四个生物学重复的平均值；

图6为本发明接种中华根瘤固氮菌株系h6对植株地上部、根部钾含量影响，将接种标准菌株usda1002(1002)，h6，以及不接种的苜蓿品种中苜三号(zm)和阿尔冈金(gj)植株生长两周，加入不同nacl浓度的盐处理营养液(0和100mmnacl)，每三天浇一次，并在处理后两周收获，图中的数据是具有标准误差的四个生物学重复的平均值；

图7为本发明接种中华根瘤固氮菌株系h6对植株地上部、根部磷含量影响，将接种标准菌株usda1002(1002)，h6，以及不接种的苜蓿品种中苜三号(zm)和阿尔冈金(gj)植株生长两周，加入不同nacl浓度的盐处理营养液(0和100mmnacl)，每三天浇一次，并在处理后两周收获，图中的数据是具有标准误差的四个生物学重复的平均值。

具体实施方式

实施例1

中华根瘤固氮菌株系h6的分离和纯化：

取新鲜根瘤，用水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，先放入体积浓度为95％的乙醇中处理3分钟，取出，用无菌水冲洗5-6次，再放入体积浓度为0.2％hgcl2灭菌5分钟，取出，用无菌水冲洗5-6次，然后再将新鲜根瘤在火焰灭过菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向yma培养基表面划线，yma培养基的配方如表1所示，倒置后在温度28℃下培养；

表1yma(yeastmannitolagar)培养基配方(/l)

待长出菌体后，从平板上挑选形态上像根瘤菌的菌落在平板上划线培养，3天之后观察菌落情况，一直观察到15天，因为慢生根瘤菌需7-15天出现菌落；根据菌落形态和菌体形态两个方面可初步判断是否为根瘤菌：

菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质或多或少，培养3-5天菌落直径达2-4mm为快生型根瘤菌，培养7-10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌；

菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察，根瘤菌为(0.5-0.9)×(1.2-0.3)μm的小杆菌，内常含β-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(g^-)，无芽孢，菌体单个或成对，如菌落菌体均像根瘤菌，则将标记好的那个菌落接入试管斜面培养保存；

本实施例的菌株为快生型，在菌落形态上为圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多；在yma平板上生长3天后的直径为0.8-2.0mm(图1)；最适生长条件为：温度28℃，转速200r/min，能够利用广泛的碳源和氮源；经革兰氏染色反应镜检均为g^-，呈小短杆状(图2)。

利用该分离纯化的方法，经过若干代反复纯化，在固体培养基yma(表1)中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经过回接试验验证其结瘤固氮能力，本实施例分离纯化到耐盐高效中华根瘤固氮菌株系h6。

实施例2

中华根瘤固氮菌株系h6的16srdna序列测序：

使用试剂盒提取菌株的总dna，进行pcr特异性扩增，pcr扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检验后，送到生工公司进行序列测定，测序结果如seqidno:1所示；

根瘤菌(sinorhizobium)

>h6

从genbank数据库中获取参比菌株，应用软件mega对分离菌株和参比菌株的16srdna部分序列进行分析，构建分离菌株h6与标准菌株usda1002(x67222.2)的系统发育关系图，如图3所示，从而确定分离出来的根瘤菌h6为中华根瘤菌属(sinorhizobium)的新菌株。

实施例3

回接试验：

本实验使用苜蓿品种为中苜三号(zm)和阿尔冈金(gj)，根据水培实验筛选出的，zm是营养生长时期耐盐品种，gj为盐敏感品种，作为根瘤菌耐盐性苜蓿回接实验植株材料；设置不接根瘤菌(-ri)，接根瘤菌标准菌株usda1002和中华根瘤固氮菌株系h6三种接菌处理，盐处理分为0mm和100mm两个nacl盐分梯度，试验采取完全随机区组设计，每个处理4次重复；

试验于华南农业大学根系生物学中心811培养室中进行，将洗干净的石英砂，按粗、中、细砂按1:2:1混合均匀后高温灭菌，装入直径5cm，高15cm的盆中，苜蓿种子按上述方法灭菌后置于1/4hoagland营养液湿润的滤纸培养皿中暗培养12h，取露出根尖的有活力的种子移入盆栽中，每盆点4粒种子，一周后间苗，并进行接菌处理，菌液要求od值大于1，取1ml接入苜蓿根部周围，接菌一周后进行盐分处理，设置0mm和100mm的nacl处理，称取相应浓度的nacl加入1/4hoagland低氮营养液，调节ph5.8-6.0之间，3天一次；

植株生长4周后收获，测定各项指标，结果如下：由图4接种根瘤菌对苜蓿生物量的影响中可以看到，对比不接菌的植株，在不加盐处理下，接种标准菌株usda1002和中华根瘤固氮菌株系h6均可增加苜蓿的生物量，而在盐处理下，接种中华根瘤固氮菌株系h6增加生物量的效果好于标准菌株usda1002，并显著好于不接种处理(表2)；

表2回接实验中盐处理、基因型、接种处理，及其交互作用对苜蓿生长影响的三因素方差分析结果

注：1)f值为三因素方差分析结果。其中，s代表盐处理，g代表基因型，i代表接种处理，s×g代表盐处理与基因型的交互作用，s×i代表盐处理与接种处理的交互作用，g×i代表基因型与接种处理的交互作用，s×g×i代表盐处理、基因型和接种处理间的交互作用。2)*：p<0.05，**：0.001<p<0.01，***：p<0.001，ns：差异不显著；

由图5接种中华根瘤固氮菌株系h6对苜蓿地上部和根部氮含量的影响：对比不接菌的植株，在不加盐处理下，接种标准菌株usda1002和中华根瘤固氮菌株系h6均可增加苜蓿的地上部和根部氮含量，并且在耐盐品种中苜3号中二者效果相同，而在盐敏感品种阿尔冈金中接种标准菌株usda1002的效果好于中华根瘤固氮菌株系h6。而在盐处理下，接种中华根瘤固氮菌株系h6增加根部氮含量的效果好于标准菌株usda1002，并显著好于不接种处理(表2)；

由图6接种中华根瘤固氮菌株系h6对苜蓿地上部和根部钾含量的影响：对比不接菌的植株，在不加盐处理下，接种标准菌株usda1002和中华根瘤固氮菌株系h6均可增加苜蓿的地上部钾含量，并且在耐盐品种中苜3号中二者效果相同，而在盐敏感品种阿尔冈金中接种标准菌株usda1002的效果好于中华根瘤固氮菌株系h6。然而，在盐处理下，接种中华根瘤固氮菌株系h6增加根部钾含量的效果明显好于标准菌株usda1002，并显著好于不接种处理(表2)；

由图7接种中华根瘤固氮菌株系h6对苜蓿地上部和根部磷含量的影响：对比不接菌的植株，在不加盐处理下，接种标准菌株usda1002和中华根瘤固氮菌株系h6均可增加苜蓿的地上部和根部磷含量，并且在耐盐品种中苜3号中二者效果相同，而在盐敏感品种阿尔冈金中，地上部磷含量在接种标准菌株usda1002的效果好于中华根瘤固氮菌株系h6。然而，在盐处理下，接种中华根瘤固氮菌株系h6增加根部磷含量的效果明显好于标准菌株usda1002，并显著好于不接种处理(表2)。

本发明所述的一种中华根瘤固氮菌株系h6，经试验研究表明：在加盐处理下，使用中华根瘤固氮菌株系h6有较明显的增产效果，苜蓿的生物量、氮含量、钾含量，以及磷含量等指标均高于不接种的植株，并且高于接种标准菌株usda1002，表明接种中华根瘤固氮菌株系h6能帮助植物缓解盐害。可见中华根瘤固氮菌株系h6可以用于新疆盐渍化土壤地区苜蓿生产上大面积的推广施用。

序列表

<110>新疆农业大学

<120>中华根瘤固氮菌株系h6及其应用

<130>2018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1849

<212>dna

<213>中华根瘤固氮菌株系h6(sinorhizobiumsp.)

<400>1

cacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcccttg60

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