本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种利用嗜热脂肪芽孢杆菌突变菌生产芽孢的方法。
背景技术
芽孢为细菌停止生长时所产生的休眠体，芽孢对低温、高温、干旱等不良环境有很强的抵抗力，而嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢萌发产酸不产气，溴甲酚紫指示剂在酸性条件下会由紫色变为黄色，利用此原理可用来快速检测乳品中抗生素残留情况。人如果长期食用抗生素含量超标的牛奶会导致人体产生耐药性，使体内菌群失调，造成严重不良后果。利用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢检测牛奶中抗生素残留是目前为止最为快速便捷经济的方式。
目前嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备主要有固体发酵和液体发酵两种方法。固体发酵方法所得的芽孢产量小，不适合大规模生产，液体发酵方法可以弥补固体发酵法产量小的不足，是工业生产最适合的方法。但目前液体制备嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的工艺繁琐、产芽孢率不稳定，因此急需对液体发酵方法进行改进。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用嗜热脂肪芽孢杆菌突变菌生产芽孢的方法，即一种操作简便、产孢率稳定的液体发酵芽孢制备方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种制备芽孢的方法，所述的方法包括如下的步骤：
1)菌种活化：将嗜热脂肪土芽孢杆菌yb1-1株通过划线接种于菌种活化培养基上进行培养；
培养温度为60-65℃；培养时间为8-14h。
2)芽孢扩增：将活化后的yb1-1株接种于芽孢扩增培养基置于水浴摇床中进行培养；
其中水浴摇床培养温度为55-60℃；摇床转速为120-150r/min；培养时间为24-48h；
所述的菌种活化培养基按照重量百分比组成如下：营养琼脂2-3.5％，cacl20.01-0.05％，feso4·7h2o0.001-0.005％，mncl2·4h2o0.1-0.5％，mgso40.01-0.05％。
所述的芽孢扩增培养基，其质量百分比组成如下：营养肉汤1.5％，cacl20.05-0.1％，feso4·7h2o0.001-0.005％，mncl2·4h2o0.5-1％，mgso40.01-0.05％，羧甲基纤维素钠0.1-0.5％。
本发明方法所使用的嗜热脂肪芽孢杆菌，为嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)yb1-1株，于2018年4月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno：15559。
本发明的方法培养过程的yb1-1菌株的芽孢产率达到80％以上。另外，本发明的方法仅需两个步骤，最短耗时32h便可获得大量芽孢，且上述产芽孢过程具有良好重复性。能够满足大规模商业生产的需求。
具体实施方式
申请人在制备芽孢的过程中筛选获得了一株能够高效产芽孢的嗜热脂肪芽孢杆菌突变株，并建立了一种制备芽孢的方法，从而弥补现有技术的不足。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述
实施例1嗜热脂肪芽孢杆菌的筛选
将实验室保存的嗜热脂肪芽孢杆菌在活化培养基培养超过72h后，发现菌落形态发生改变，部分菌落从浅黄色透明状变化为乳白色不透明状，将两种形态的菌落分别纯化，获得两种纯化菌株，其中透明菌株在活化培养基培养24h后芽孢产率为10％，乳白色菌株在活化培养基培养24h后芽孢产率为80％，将该菌株命名为嗜热脂肪土芽孢杆菌yb1-1株。同时使用标准菌株嗜热脂肪地芽孢杆菌(cicc：10267)，在上述同样条件下培养24h芽孢产率为30％。嗜热脂肪土芽孢杆菌yb1-1株的性质如下：革兰氏阳性，需氧兼性厌氧，过氧化氢酶阴性，接触酶阳性，显微镜下杆状，芽孢成椭圆状。
筛选获得的嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillustearothermophilus)yb1-1株，于2018年4月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno：15559。
实施例2一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法
分别将嗜热脂肪土芽孢杆菌yb1-1株和对照标准菌株嗜热脂肪地芽孢杆菌cicc10267株按照下述步骤培养：
步骤1)芽孢激活：
将菌株接种于菌种活化培养基(营养琼脂3％，cacl20.01％，feso4·7h2o0.001％，mncl2·4h2o0.3％，mgso40.01％)，置于65℃培养箱培养8h。
步骤2)芽孢扩增
取1g的经芽孢激活后的嗜热脂肪芽孢杆菌，接种与1l的芽孢扩增培养基(营养肉汤1.5％，cacl20.05％，feso4·7h2o0.001％，mncl2·4h2o0.5％，mgso40.01％，羧甲基纤维素钠0.1％)，置于60℃，120r/min水浴摇床培养32h。
步骤3)芽孢检测
取1ml菌液进行测定及镜检，所述的镜检方法为：取50ul菌悬液置于载玻片中央，在酒精灯上进行加热固定，固定完成后在75℃用6.7％的孔雀石绿进行芽孢染色5min，染色完毕将孔雀石绿冲洗干净，利用沙黄复染5min，冲洗干净后在100倍油镜下观察。可以看到菌体被染成红色，芽孢为绿色。
结果表明yb1-1株芽孢产率为80％，而cicc10267株芽孢产率仅为30％；同时，yb1-1株菌液在600nm吸光值为0.87，说明该菌株可在上述培养条件下旺盛生长。将最后培养得到的yb1-1株菌液常温6000r/min离心6min，取沉淀，用无菌生理盐水按其重量的50倍复溶，在100℃水浴加热30min，最终制得芽孢悬液。制得的芽孢悬液可用于商业生产。
实施例3高效生产芽孢的方法
分别将嗜热脂肪土芽孢杆菌yb1-1株和对照标准菌株嗜热脂肪地芽孢杆菌cicc10267株按照下述步骤培养：
步骤1)芽孢激活：
将菌株接种于菌种活化培养基(营养琼脂3％，cacl20.01％，feso4·7h2o0.001％，mncl2·4h2o0.3％，mgso40.01％)，置于65℃培养箱培养14h。
步骤2)芽孢扩增
取1g的经芽孢激活后的嗜热脂肪芽孢杆菌，接种与1l的芽孢扩增培养基(营养肉汤1.5％，cacl20.05％，feso4·7h2o0.001％，mncl2·4h2o0.5％，mgso40.01％，羧甲基纤维素钠0.1％)，置于60℃，120r/min水浴摇床培养72h。
步骤3)芽孢检测
取1ml菌液进行测定及镜检，所述的镜检方法为：取50ul菌悬液置于载玻片中央，在酒精灯上进行加热固定，固定完成后在75℃用6.7％的孔雀石绿进行芽孢染色5min，染色完毕将孔雀石绿冲洗干净，利用沙黄复染5min，冲洗干净后在100倍油镜下观察。可以看到菌体被染成红色，芽孢为绿色。
最终由嗜热脂肪土芽孢杆菌yb1-1株培养得到的芽孢产率为99％，由对照标准菌株嗜热脂肪地芽孢杆菌cicc10267株培养得到的芽孢产率为30％。
实施例4芽孢的应用
上述芽孢可以应用在牛奶抗生素快速检测试剂盒的制备，具体方法如下：
(1)试剂盒制备
将实施例2中制备的芽孢与培养基(蛋白胨1％，葡萄糖1％，琼脂1％，0.1％溴甲酚紫，用1mol/ltris调节ph为8.2)，按照1：20比例混合，取100μl注入到酶标板中，凝固后封口，制备试剂盒。
(2)抗生素检测
取试剂盒中每个小管，加100μl待检测牛奶样品，在55-60℃培养箱培养2.5-3h后观察颜色变化。若试剂盒培养基呈现黄色，则表明待检测样品抗生素未超标，若试剂盒呈现紫色，表明待检样品抗生素超标。