本申请属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种细脚棒束孢wswm1171及其在马铃薯块茎蛾蛹防治中的应用。
背景技术
细脚棒束孢(isariatenuipes)，曾用名细脚拟青霉(paecilomycestenuipes)，属于子囊菌门(ascomycota)，核菌纲(pyrenomycetes)，肉座菌目(hypocreales)，麦角菌科(clavicipitaceae)，棒束孢属(isaria)，是鳞翅目昆虫的一种常见的昆虫病原真菌，该菌具有寄主专化性，在鳞翅目的蛹上较为流行，在世界各地均有分布，在森林生态系统中对昆虫种群具有重要的调节作用，因其产生的次级代谢产物具有抗肿瘤、抗菌、抗忧郁以及改善睡眠等方面具有独特的功能，在中国传统中药中广泛运用。
马铃薯块茎蛾(phthorimaeaoperculellazeller)属于鳞翅目(lepidoptera)，麦蛾科(gelechiidae)，麦茎蛾属(phthorimaea)，是一种主要分布于热带和亚热带的世界性分布的茄科植物害虫，对马铃薯的危害尤为严重。马铃薯块茎蛾繁殖力较强，对温度的耐受性高，对农药具有较强的抗性，近年一些研究报告表明，该害虫还能孤雌生殖，因此，给防治工作带来了巨大的困难。在田间，马铃薯块茎蛾幼虫主要蛀食入马铃薯植株的茎、叶内，植株受害后往往会整株枯死。在薯块储藏期，马铃薯块茎蛾将其卵产于马铃薯薯块表面，且多集中于未发芽的芽眼处，待其孵化，初孵幼虫往往由伤口及未发芽的芽眼处进入块茎，并在块茎内形成较为复杂的弯曲幼虫通道。若不加以防治，马铃薯储藏期超过一个季度后，可使其薯块的损失率达100％。
目前对于马铃薯块茎蛾蛹的防治主要还是采用化学农药。大量和长期使用化学农药容易导致病原菌产生抗性，同时还造成严重的环境污染、农药残留等问题，给人类健康和环境安全带来严重的威胁。与传统的化学农药相比，微生物源农药具有很多优点，尤其是在环境相容性和安全性方面的优势尤为明显，如对环境无污染、无残留、对人和家畜无危害等。微生物源农药被认为是传统化学农药的有效替代物，细脚棒束孢也逐渐地应用于农业作物的病害防治中。
技术实现要素：
本申请提供一种细脚棒束孢wswm1171及其在马铃薯块茎蛾蛹防治中的应用，用以提供一种运用于马铃薯块茎蛾蛹防治的微生物源菌剂研发的菌株，避免或减少由不合理使用化学农药所导致的抗药性、环境污染和人类健康威胁问题。
本申请公开的细脚棒束孢wswm1171，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏日期2018年06月04日，保藏编号cgmccno.15689。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，细脚棒束孢的获得过程为：从罹病鳞翅目蛹上分离获得野生细脚棒束孢菌株，对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，得到细脚棒束孢。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，所述对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，包括：
将细脚棒束孢菌株在pda培养基上培养14天，使得菌落直径长达5.19-6.31cm，菌落中心呈白色粉状同心圆，边缘呈透明扫帚状。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，所述对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，包括：
将细脚棒束孢菌株在sday培养基上培养14天，使得菌落直径长达2.26-2.59cm，菌落正面呈淡黄色绒毛状凸起，边缘呈透明放射状。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，所述对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，包括：将细脚棒束孢菌株在查氏培养基上培养14天，使得菌落直径长达2.50-2.95cm，菌落正面呈灰白色、绒毛状、平展，背面呈淡棕色、光滑无褶皱。
本申请公开的细脚棒束孢wswm1171在马铃薯块茎蛾蛹防治中的应用，优选地，将马铃薯块茎蛾蛹置于浓度为1.0×108个孢子/ml的细脚棒束孢菌株的孢子悬浮液中浸渍，浸渍5s后取出，用灭菌滤纸吸干多余水分，然后将接种后的蛹置于预先在底部加入无菌湿润棉花的24孔的细胞培养板中，置于25℃的16l:8d光照培养箱中饲养，7天后，马铃薯块茎蛾蛹的累积死亡率为100％。
本发明提供的细脚棒束孢wswm1171及其在马铃薯块茎蛾蛹防治中的应用具有以下优点：
1、利用采集于鳞翅目蛹的菌株，该菌具有寄主专化性，仅侵染鳞翅目蛹，其分生孢子对马铃薯块茎蛾蛹具有强致病力。
2、可以克服马铃薯块茎蛾防治中产生的对环保污染、食品安全、抗药性以及对天敌昆虫的杀伤等问题，可以广泛地用于马铃薯块茎蛾蛹的生物防治。
具体实施方式
以下将详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本申请发明人于2017年3月，在对云南省西双版纳自然保护区虫生真菌调查发现，细脚棒束孢wswm1171在鳞翅目蛹上大量发生流行，引起大量的鳞翅目蛹感染死亡，因此，该菌株在热带森林生态系统中对鳞翅目蛹具有强致病力的虫生真菌，在防治马铃薯块茎蛾蛹的生物防治中具有很大的开发应用前景。
本发明的目的在于提供一种细脚棒束孢wswm1171及其应用，旨在克服马铃薯块茎蛾幼虫为钻蛀性害虫，现有的防治技术较难达到理想效果，然而其幼虫钻蛀入叶片或块茎内，增加了防治难度，但是该虫有一个重要的生物学特性为防治提供一个突破口，既其老熟幼虫会由薯块、叶片、茎秆内爬出，进入枯叶表面、块茎表面或土壤中化蛹。因此，该害虫蛹期是防治的最佳时期。
本申请公开的细脚棒束孢wswm1171，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏日期2018年06月04日，保藏编号cgmccno.15689。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，细脚棒束孢的获得过程为：从罹病鳞翅目蛹上分离获得野生细脚棒束孢菌株，对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，得到细脚棒束孢。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，所述对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，包括：
将细脚棒束孢菌株在pda培养基上培养14天，使得菌落直径长达5.19-6.31cm，菌落中心呈白色粉状同心圆，边缘呈透明扫帚状。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，所述对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，包括：
将细脚棒束孢菌株在sday培养基上培养14天，使得菌落直径长达2.26-2.59cm，菌落正面呈淡黄色绒毛状凸起，边缘呈透明放射状。
如上所述的细脚棒束孢wswm1171，其中，所述对细脚棒束孢菌株进行单孢分离、培养，包括：
将细脚棒束孢菌株在查氏培养基上培养14天，使得菌落直径长达2.50-2.95cm，菌落正面呈灰白色、绒毛状、平展，背面呈淡棕色、光滑无褶皱。
本申请公开的细脚棒束孢wswm1171在马铃薯块茎蛾蛹防治中的应用，优选地，将马铃薯块茎蛾蛹置于浓度为1.0×108个孢子/ml的细脚棒束孢菌株的孢子悬浮液中浸渍，浸渍5s后取出，用灭菌滤纸吸干多余水分，然后将接种后的蛹置于预先在底部加入无菌湿润棉花的24孔的细胞培养板中，置于25℃的16l:8d光照培养箱中饲养，7天后，马铃薯块茎蛾蛹的累积死亡率为100％。
本申请实施例的细脚棒束孢wswm1171对于马铃薯块茎蛾蛹，具有强致病力。通过该菌剂防治马铃薯块茎蛾蛹，从而达到消退种群数量，使害虫处于经济阈值之下，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性和食品安全问题。
实施例一、病原菌的分离、鉴定
1.1材料与方法
1.1.1采集地点
该菌株采集于云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐仑镇巴卡小寨五十五石灰岩山地雨林中(n21°57′55″，e101°12′22″，海拔763米)的一种鳞翅目蛹上。
1.1.2分离培养及形态观察
将标本带回带实验室后，采用萨氏(sday)培养基(葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸粉10g，琼脂20g，ph自然)进行分离培养。培养7天后，将分生孢子转接到新的培养基上进行纯化。
形态观察，采用粘性较好的透明胶，在菌落边缘粘去少量的菌丝，置于95％的酒精固定5秒，后采用棉蓝染色液(甲基蓝0.025g，乳酸10g，甘油20g，蒸馏水10ml)进行染色，后运用显微镜观察拍照。
1.3dna提取及pcr扩增
采用北京索莱宝生物有限公司的真菌dna专用提取试剂盒(货号：d2300)进行提取，试验前，将真菌加液氮研磨，其余步骤按说明书进行。
its序列的pcr扩增，pcr反应体系25μl：引物its1和its4各1μl，pcrmix12.5μl，templatedna2μl，ddh2o8.5μl。反应条件:94℃预变性5min；94℃变性1min，57℃退火2min，72℃延伸1min，32个循环；72℃，总延伸5min。1.8％电泳检测。pcr产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。
1.4系统发育分析
根据测序结果，将序列进行编辑，去除两端质量较差的碱基，将优化好的its序列，提交到网站ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，运用blast程序进行比对。序列经blast后下载相似性大于84％的序列及其相关近缘属菌株的its序列，用mega6.06进行序列处理，应用最大似然法(ml)，运行1000次bootstrap验证，构建系统发育树(kumaretal.2004)。
1.5结果
该菌株罹病虫体在野外大部分位于土壤中，也有包裹于植物叶片或位于枯枝内，其孢子束长度根据其虫体大小或环境而不同，较大的蛹体可形成长达5cm的孢子束，较小蛹体可形成0.07cm～1.2cm孢子束。孢子束基部呈米黄色、光滑、致密、分支，头部呈棒状或珊瑚状，形成白色至黄白色孢子粉。
培养特征及孢子特征：在pda培养基上，培养14天，菌落直径长达5.19～6.31cm，菌落中心白色，粉状，形成同心圆，边缘透明，扫帚状。在sday培养基上，培养14天菌落直径长达2.26～2.59cm，菌落正面淡黄色，绒毛状，凸起，边缘透明放射状。在查氏培养基上，培养14天其菌落直径长达2.50～2.95cm，菌落正面灰白色，绒毛状，平展，背面淡棕色，光滑无褶皱。瓶梗基部拟椭圆性或球型膨大，5.81～12.026×2.035～2.396。分生孢子卵形、椭圆形，形成长链，其孢子大小为(3.715～4.283×1.702～3.166)μm。
分子鉴定结果：根据公司的测序结果，采用contigexpress软件进行去除两端测序质量较差的序列，与ncbi数据库进行比对，结果发现该菌株与数据库中的菌株isariatenuipesstrainaspphp1(登录号：kj004029.1)的相似性为100％。此外，系统发育分析也表明该菌与isariatenuipesstrainaspphp1聚为一支，说明该菌与细脚棒束孢isariatenuipes具有同源性，也更加说明了该菌的分类地位，应属于细脚棒束孢。
综述所述，根据其感染症状、培养形态及孢子形态，并根据《昆虫真菌学》(蒲蜇龙，李增智，1996)和《中国真菌志第四十三卷拟青霉属棒束孢属戴氏霉属》(梁宗琦，2007)有关细脚棒束孢感染症状、菌丝和分生孢子的形态特征和分子序列比对结果进行鉴定，最终确定该菌株为细脚棒束孢。
实施例2、细脚棒束孢wswm1171在马铃薯块茎蛾蛹室内毒力测定
2.1不同接种方法高毒力菌株对马铃薯块茎蛾蛹的侵染致病力
2.1.1供试虫源
供试马铃薯块茎蛾采集于云南省宣威市板桥镇马铃薯种植区(海拔1967m，n26°05′52.3″，e104°04′27.5″)。参照rondon等(2010)饲养方法，在有机玻璃透明养虫箱(长×宽×高＝40×40×40cm)的内铺一薄层消毒细沙，然后在其上放置一层新鲜马铃薯薯块，放入野外收集幼虫或成虫，置于温度26℃，湿度为70％，光照时间16h的人工气候箱(宁波海曙赛福实验仪器厂，型号为rxz-260b-30)，任其大量繁殖。收集大量同一天的卵，待其孵化后将幼虫挑到马铃薯块茎上饲养，待其化蛹后，收集同一天蛹，供其试验所需。
2.1.2孢子悬浮液的制备及毒土的配制
将细脚棒束孢菌株wswm1171菌株接于pda培养基上，待其产生大量的分生孢子后，无菌水将分生孢子洗下并过滤配置成分生孢子菌悬液，用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，并制备成不同浓度的孢子悬浮液，即1×108个孢子/ml、1×107个孢子/ml、1×106个孢子/ml、1×105个孢子/ml、1×104和1×103个孢子/ml的孢子浓度的菌悬液，对照组以0.05％无菌吐温-80为对照。
供试土壤采集于云南农业大学后山森林，将地表层的残枝碎叶清除掉，然后用铁铲采集距土表10cm以下的腐殖质沙土。将其带回实验室先过30目筛，形成均匀的细沙土，一份采用121℃、101kpa高压灭菌20min，烘干后备用用。一份未做任何处理。同上所述将其配制成3×108、3×107、3×106、3×105、3×104和3×103个孢子/ml的孢子悬浮液，将各浓度梯度的孢子悬浮液与灭菌处理和未灭菌处理的细沙土以质量比1:3于无菌玻璃培养皿混匀，配成终浓度分别为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104和1×103个孢子/g的毒土供试验所用，对照组同样以相同量的无菌0.05％吐温-80于土中作为对照
2.1.3采用浸渍法接种
选择大小一致、健康的1日龄马铃薯块茎蛾蛹，分别采用浸渍法进行接种，将马铃薯块茎蛾蛹置于各菌株孢子悬浮液浸渍5s，浸渍后取出，用灭菌滤纸吸干多余水分，然后将接种后的蛹置于预先在底部加入无菌湿润棉花24孔的细胞培养板中，置于25℃的16l:8d光照培养箱中饲养。每天定时观察，以镊子轻触蛹体，以蛹不动为死亡，连续观察7d，并将死亡虫体在25℃和16l:8d条件下保湿培养，根据虫体是否长出菌丝及菌丝形态确定各虫的死亡原因。每株菌设置5个重复，每重复20头虫。
2.1.4灭菌毒土法和未灭菌毒土法
选择大小一致、健康的1日龄马铃薯块茎蛾蛹，将其埋于已加入不同孢子浓度的灭菌毒土和未灭菌毒土表面，然后置于25℃的16l:8d光照培养箱中饲养，每天定时观察记录死亡蛹量后，虫体是否死亡的判断方法同浸渍法，试验期间按需向毒土中加入少量的无菌水进行保湿，连续观察7d，并将死亡虫体在25℃和16l:8d条件下保湿培养，根据虫体是否长出菌丝及菌丝形态确定各虫的死亡原因。每处理重复3次，每重复20头虫。
2.1.5数据分析与统计
采用excel2010进行数据整理，通过dps数据处理系统14.0软件分析“时间—剂量—死亡率”模型(time－dose－mortalitymodel，tdm)中的时间效应(如lt50和lt90)、剂量效应(如lc50和lc90)及时间与剂量间互作效应。
2.2结果
2.2.1不同接种方法下脚棒束孢菌株wswm1171对马铃薯块茎蛾蛹的累积死亡率
采用浸渍法、无菌毒土法和带菌毒土法，评价了细脚棒束孢菌株wswm1171对马铃薯块茎蛾的蛹的侵染致病力。孢子浓度为1.0×108孢子/ml浸渍法接种后第7天时，马铃薯块茎蛾蛹的累积死亡率100％。孢子浓度为1.0×108孢子/g的灭菌和未灭菌毒土法接种后第7天时，其累积死亡率分别为83.330％和73.33％。由此表明，细脚棒束孢菌株wswm1171对马铃薯块茎蛾的蛹具有良好的毒杀防治作用。
2.2.2细脚棒束孢菌株wswm1171对马铃薯块茎蛾蛹侵染致病的剂量效应
根据其“时间-剂量-死亡率”模型，采用浸渍法接种后第3、5、7天时，lc50估计值分别为3.068×106、8.065×104和2.660×103孢子/ml，lc90估计值分别为1.641×108、4.314×106和1.423×105孢子/ml；灭菌毒土法接种后第3、5和7天时，lc50估计值分别为1.165×1010、1.359×108和2.764×107孢子/g，lc90估计值分别为9.167×1010、2.891×109和9.172×108孢子/g；未灭菌土法lc50估计值分别为1.512×1011、6.621×107和1.392×106孢子/g，lc90估计值分别为7.102×1013、3.110×1010和6.536×108孢子/g。结果表明，细脚棒束孢菌株wswm1171对马铃薯块茎蛾蛹具有较高的侵染致病作用。
2.2.3细脚棒束孢wswm1171对马铃薯块茎蛾蛹侵染致病的时间效应
用1×103～1×108孢子/ml浓度浸渍法接种后，其lt50分别为6.213、4.863、3.556、2.718和2.337d；用1×106～1×108孢子/ml灭菌毒土法接种后，其lt50分别为5.645、4.492和3.769d。用1×108孢子/ml和1×107孢子/ml未灭菌毒土法接种时，lt50分别为5.587d和4.690d。
综述所述，三种接种方法对马铃薯块茎蛾蛹均具有较好的致死剂量和时间效应，浸渍法对马铃薯块茎蛹的致病半致死剂量和半致死时间均小于无菌毒土法和灭菌毒土法。而无菌毒土法接种下，对马铃薯块茎蛾蛹的半致死剂量和半致死时间均小于灭菌毒土法。即使无菌毒土法和带菌毒土法接种下，细脚棒束孢菌株wswm1171对马铃薯块茎蛾蛹的侵染致病力低于浸渍法，但是仍然具有较高的侵染致病力，由此说明，细脚棒束孢菌株wswm1171具有运用于马铃薯块茎蛾蛹田间防治的潜力。
该菌株是本申请发明人首次从西双版纳热带地区鳞翅目蛹上分离纯化获得的细脚棒束孢菌株wswm1171，cgmccno.15689。于室内采用灭菌毒土和未灭菌毒土对马铃薯块茎蛾蛹在田间防治的模拟，相对于传统的浸渍法，未灭菌毒土对马铃薯块茎蛾蛹的致病致病力，有所下降，但是仍然具有较高的侵染致病力。因此，该菌株对于马铃薯块茎蛾的防治具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治马铃薯块茎蛾，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药性、环境污染、食品安全以及损害天敌等问题，将为马铃薯块茎蛾的绿色防控提供依据。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。