一种田间采用抗性平板筛选和试纸条鉴定组合分离青枯病菌的方法与流程

本发明涉及在田间进行青枯病菌的快速分离，具体是一种田间采用抗性平板筛选和试纸条鉴定组合分离青枯病菌的方法，能够在田间无相关技术设备的情况下进行青枯病菌的分离。

背景技术：

烟草青枯病由青枯雷尔氏菌[ralstoniasolanacearum]引起,其主要通过土壤传播,病菌由根冠或者根部伤口侵入植物后通过木质部导管向上扩散到植株地上部,其分泌的细胞外多糖eps能够堵塞导管,导致水分从根部向上运输困难,叶子等地上部缺水,全株萎蔫死亡。一般在温带和热带烟区发生,发病范围在长江流域及其以南烟区,近年来有向北部发展的态势。其高温高湿条件下，青枯病发病极快，爆发后防治较难，常与根黑腐病、黑胫病和根结线虫病等混合发病，在极端气候下局部烟田发病率可高达80%～90%，造成毁灭性损失，已成为我国南方烟叶生产上的重要制约因素。因为夏天高温高湿，将烟杆采完后，带回实验室的过程中，如果时间较长，会导致烟杆腐烂，杂菌丛生，从而很难分离到青枯病菌，这里采用抗性平板筛选的方式从田间分离，直接在田间地头进行青枯病菌的筛选，能够高效地对青枯病菌进行分离，避免了运输过程的问题。

技术实现要素：

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种田间采用抗性平板筛选和试纸条鉴定组合分离青枯病菌的方法，即设计了一种抗性筛选平板和一套田间简易分离操作技术，能够在田间无相关技术设备的情况下，进行青枯病菌的分离。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）抗性筛选平板的准备

将青枯病高感品种红花大金元新鲜烟叶采用磨样机粉碎后，按照5g/l的浓度加入去离子水，同时加入胰蛋白胨5g/l，酵母浸膏25g/l,葡萄糖1g/l,琼脂粉15g/l,将ph值调整至6.5左右后121℃20min灭菌，等培养基温度降低至50℃左右，每升培养基加入500μl1%多粘菌素b，100μl1%氯霉素，500μl1%放线菌酮，超净工作台上按照20ml/皿倒平板，等冷却后采用封口膜密封。

（2）采样

选取青枯病发病田块，采用酒精消毒过的镰刀，砍取青枯病株，发病和健康组织交界处往上约15cm，往下约5cm的烟杆，从一个田块采集约15株，放入质控袋密封，并标记地点，将密封袋放置于田间阴凉处。

（3）划线培养

将截取烟杆段放置1个小时后，其横截面会有白色菌脓流出，然后采用牙签挑取菌脓，直接在抗性平板上进行采用3线法进行划线后，采用封口膜对平板进行密封。

（4）菌种分离

在培养1-2天后，将长有众多菌种的平板上挑取白色的菌斑，在新的抗性平板上采用3线法进行重新划线，然后封口膜密封，室温放置进行培养。

（5）菌株鉴定

青枯病菌菌株的鉴定采用美国agdia公司青枯病菌检测试纸条，挑取分离的较纯的菌斑，放入试纸条自带的缓冲抽提液，放置10分钟后，采用试纸条进行检测，在t位和c位都存在阳性的确认为青枯病菌菌株。

步骤（1）中抗性平板的制备，在实验室进行，封口膜密封后装入塑料袋，带往田间备用。

步骤（1）中3种抗生素母液要采用0.2um针筒式滤膜过滤器进行过滤除菌。

步骤（2）中病株切取时刀片与茎秆成一定角度切下，使截面积增大，促进菌液的析出。

本发明克服了常规青枯病菌分离的过程中，夏季高温高湿条件下，需要采取大量病株，运输过程中病株容易腐烂，很难分离到青枯病菌的问题，快速地在没有无菌设备的条件下，进行青枯病菌的分离，操作简便，可行，成功率较高。

附图说明

图1分离到的青枯病菌在na培养基上的生长情况。

图2青枯病试纸条对分离青枯病菌的检测结果，

图中左边试纸条检测t线，c线皆显红色，结果呈阳性。右边阴性试纸条，只有对照线c线为红色，t线无颜色。

具体实施方式

本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述：

具体实施过程如下：

（1）抗性筛选平板的制备

将红花大金元新鲜烟叶采用磨样机粉碎后，按照5g/l的浓度加入去离子水，同时加入胰蛋白胨5g/l，酵母浸膏25g/l，葡萄糖1g/l，琼脂粉15g/l，将ph值调整至6.5左右后121℃20min灭菌，等培养基温度降低后，每升培养基加入500μl1%多粘菌素b,100μl1%氯霉素，500μl1%放线菌酮，超净工作台上按照20ml/皿倒平板(9cm规格），等冷却后采用封口膜密封。

（2）采样

2016年6月，在江西省抚州市宜黄县、黎川县、乐安县、广昌县、资溪县和南丰县等选取青枯病发病较重田块，采用酒精消毒过的镰刀，砍取青枯病株，发病和健康组织交界处往上约15cm，往下约5cm的烟杆，从一个田块采集约15株，放入质控袋密封，并标记地点,将密封袋放置于田间阴凉处。

（3）划线培养

将截取烟杆段放置1个小时后，其横截面会有白色菌脓流出，采用牙签挑取菌脓，直接在抗性平板上进行采用3线法进行划线，采用封口膜对平板进行密封。

（4）菌种分离

在培养1-2天后，将长有众多菌种的平板上挑取白色的菌斑，在新的抗性平板上采用3线法进行重新划线，封口膜密封，室温放置进行培养（图1）。

（5）菌株鉴定

青枯病菌菌株的鉴定采用试纸条进行，挑取分离的较纯的斑，放入试纸条自带的缓冲抽提液，放置10分钟后，采用试纸条进行检测（图2），在t位和c位都存在阳性的确认为青枯病菌菌株，最终分离获得青枯病菌株33株。

技术特征：

技术总结
一种田间采用抗性平板筛选和试纸条鉴定组合分离青枯病菌的方法，包括以下步骤：（1）抗性筛选平板的准备：在实验室配制抗性培养基，超净工作台上按照20ml/皿倒平板，等冷却后采用封口膜密封。（2）采样：采用消毒镰刀砍取青枯病株发病和健康组织交界处约20cm长烟杆，放入塑料袋密封。（3）划线培养，（4）菌种再分离：在培养1‑2天后，将长有众多菌种的平板上挑取白色的菌斑，在新抗性平板上采用3线法进行重新划线培养。（5）菌株鉴定：采用青枯病菌试纸条，在T位和C位都存在阳性反应的确认为青枯病菌。该方法操作简便，成功率高，能够有效地在高温高湿环境条件下，在田间进行大量青枯病菌的初步分离。

技术研发人员：胡利伟;冯小虎;牟文君;郭建华;张志高;张友武;李琰琰;王利兵;奚家勤;戴华鑫;薛超群;王信民;尹启生;张艳玲;宋纪真
受保护的技术使用者：中国烟草总公司郑州烟草研究院;江西省烟草公司抚州市公司
技术研发日：2018.10.17
技术公布日：2019.02.12