一种快速测试纳米颗粒对藻类活性影响的方法与流程

本发明涉及一种纳米颗粒对藻类活性影响的检测方法，可以快速评价纳米颗粒对藻类的抑制和杀灭效果，便于材料性能的优化。

背景技术：

藻类作为一种简单的单细胞生物在食品、医药及环境领域都有较高的利用价值的同时，如蓝藻藻华、赤潮等藻类爆发却也会给水体生态带来灾难。研究证明，纳米材料对藻类生物可能存在毒性，对水体生态的修复起积极作用，但纳米材料对藻类的作用效果需使用一种较为简便准确的方法进行评价。现有的藻类细胞活性检测主要参照细胞体外毒性测试标准，如iso1442:1999和bseniso8692：2004，但此类标准均未明确给出纳米材料的藻类细胞毒性测试方法，且均采用细胞浓度值作为细胞活性标准，忽视了纳米颗粒引起的絮凝对结果造成的影响，且无法分辨活细胞和死亡细胞。部分文献使用荧光染色法计数虽可分辨活、死细胞，但对设备要求较高，且无法量化细胞的活性；专利(cn101201312a)发明了一种中性红染色法，不需用荧光试剂染色，但却无法避免纳米颗粒物的干扰，絮凝沉降的藻细胞仍具有增殖能力；叶绿素a测试法与细胞活性线性相关度较好，但当细胞活性负增长时其值与叶绿素含量相关性较差，且叶绿素在极端胁迫条件(强光、强酸强碱、高温)下易分解，故该法只适用于温和条件下的生长抑制实验；细胞增殖试剂法较为精确，可避免各种非可溶性杂质的干扰，但如mtt法等均较少藻类测试中使用，一方面因为mtt法产生的甲瓒不可溶，需将细胞溶解，步骤复杂，另一方面mtt法所用增殖剂的副产物有毒，藻类等需长时间测试，对实验结果及实验人员身体健康不利。

技术实现要素：

本发明针对上述问题，采用一种高可溶性四唑盐利用细胞培养的手段检测藻细胞的活性，该方法操作简便，所需仪器简单，精度高，避免了不可溶杂质对实验结果的影响，比细胞浓度、叶绿素含量更便捷准确的反映了藻细胞活性的变化，更能精确地表现纳米颗粒对藻细胞活性的影响。适用藻细胞范围广，且可用于生长抑制实验及藻类去除试验中细胞活。

本发明中的测试方法通过以下步骤实现：

(1)藻类的培养及生长抑制测试可参考标准iso1442:1999和bseniso8692：2004。

(2)将培养至对数期并经饥饿处理24h的藻类加入水体中，保证生长抑制实验保证藻细胞密度不低于10⁴cell/ml。去除实验保证细胞密度不低于10⁶cell/ml。

(3)设定光源为自然光、led可见光，紫外光等，生长抑制实验中可见光光照强度维持在液面处2000～10000lux；去除实验中如需光照可设定紫外光辐照1～10mw/cm²，可见光强度为2～15mw/cm²，光照时间根据实验要求决定，若为异养生长则可减少周期光照时间，自养生长需保证每个周期12h以上的光照时间，去除实验光照时间建议在0～24h。实验温度可设置在25～35℃之间。

(4)生长抑制实验取样间隔为24h，藻类去除实验取样间隔为1-6h。将取样后的藻液更换新的培养基，每次取100-400ul加入到孔板中，每组设置至少6个平行样，并加入1/10体积的细胞增殖试剂。在25～35℃温度下孵育4-12h，若光照会产生还原性物质，需在黑暗条件下孵育。

(5)孵育完毕后，取上清液在酶标仪或分光光度计下读数，波长选择为450nm，并用公式计算抑制率，生长抑制实验的理论抑制率为正，去除实验的理论抑制率为负(实为去除率)。

进一步地，步骤(4)所述生长抑制实验或藻类去除实验为：水体过滤、消毒后，加入试验藻液及纳米颗粒物后进行试验；抑制实验培养时间72～144h，灭活实验时间在1～96h之间，具体根据实际实验效果选择。

进一步地，步骤(4)所述孵育是：每隔固定时间取100～400ul藻液及10～40ul细胞增殖活性剂至孔板，若藻液浓度较高或过低可稀释浓缩至10⁴cell/ml，并更换培养液，每组样品至少取3个平行样，孵育4～12h使细胞贴壁后可以进行读数。

进一步地，步骤(5)所述读数：吸取孔板中的上清液，用酶标仪或分光光度计在450nm处读数，并取平均值；利用所测值根据公式计算纳米颗粒对藻类的抑制率或灭活率；

抑制率：

灭活率：

a纳指包含纳米颗粒、藻类及培养液的实验组；a对为含纳米颗粒、培养液但不含藻细胞的对照组；a藻只含藻液、培养液；a空为只含培养基的空白组。

进一步地，所用的细胞增殖试剂是一种高度水溶性的四唑盐，为(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐等中的一种；四唑盐可与呼吸作用产生的脱氢酶反应生成水溶性甲瓒，不需要洗涤溶解操作即可间接反映细胞增殖活性；所述在常温下至少可保存1个月，4℃保存12个月以上；每次使用藻液体积的1/10即可；测试结果可排除纳米颗粒及还原性物质带来的影响，不仅可用于纳米材料对藻类的生长抑制测试，还可用于藻类灭活测试。

进一步地，所述细胞增殖试剂为cck-8或wst-1。

进一步地，藻细胞由于具有较厚的细胞壁(尤其是真核绿藻)，四唑盐与胞内脱氢酶的结合较为困难，细胞活性敏感程度低于一般微生物细胞及动物组织细胞，需要更长的孵育时间才能达到饱和吸光度。附图1为一种淡水小球藻不同接种细胞密度时孵育12后饱和吸光度与孵育时间的关系，当接种密度低于10³cell/ml时，孵育时间12h后吸光度值变化幅度较低，故不利于检测细胞活性变化。而接种密度远大于10⁵cell/ml时，饱和吸光度值在1.3左右，不随密度增大产生大幅度变化，这是因为四唑盐被快速消耗殆尽，可溶性甲瓒的生成量快速达到极限值，不再增长，由此可见最佳接种细胞浓度应控制在10⁴～10⁵cell/ml，此时细胞密度与吸光度间线性相关性最好。

进一步地，当进行藻类灭除实验时，藻细胞浓度达到10⁶cell/ml，故在接种至孔板时需进行稀释，保证接种浓度在最佳区间10⁴～10⁵cell/ml。

进一步地，当加入的纳米物质具备还原性质时，如光催化材料在光照下会产生还原性电子、超氧自由基等具有弱还原性的物质，故在孵育培养时需避免光照，并在读数时排除其影响。纳米颗粒浓度最好在10～500mg/l，保证其浓度与藻液细胞浓度间有恰当的比例关系。

进一步地，纳米颗粒活性试验与孔板细胞培养需分开进行，虽然四唑盐毒性很低，但仍需排除其对纳米颗粒及藻细胞的影响，不宜与活性试验同时进行，尤其是当纳米颗粒的粒径对活性关系较大时(纳米颗粒浓度高于5mg/l时)需在有搅拌的条件下进行测试，然后再在孔板中加入增殖试剂孵育细胞。(孵育前更换培养基)孵育时四唑盐及其生成的甲瓒不会与纳米颗粒发生反应，故可反映毒性实验后细胞的增殖活性。附图2为一种zno纳米颗粒浓度对接种浓度为5×10⁴cell/ml的小球藻的增殖剂吸光度大小的影响，可见纳米颗粒的加入并未显著影响吸光度值(p>0.05)，即一般的纳米颗粒不影响增殖剂读数。

本方法与其它方法相比其优势与区别在于：

(1)该方法操作步骤简单，仪器要求低。而计数法计数耗时大，而叶绿素分光光度法则步骤繁琐。

(2)精度高，可将沉降甚至濒死细胞的活性囊括在内，避免了计数法无法分别细胞死活及漏记、不计的弊端，且能比染色法更好的表现细胞活性的微小变化。

(3)该方法不仅可用于生长抑制实验，还可用于快速灭活测试。与叶绿素a分光光度法相比，可灵敏表现细胞生物量下降的趋势，这是因为在强光照、高温等条件下叶绿素较易分解流失，而当细胞活性降低但细胞结构完整时，叶绿素却可长期保存。故叶绿素法只适合测试生物量的增长，不适用于藻类灭活指标。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

附图1为一种淡水小球藻细胞接种密度与孵育12h后增殖剂吸光度间的关系。

附图2为一种zno纳米颗粒浓度-的增殖剂吸光度的关系图。

附图3为一种p25纳米颗粒对藻类的生长抑制实验的测试结果，比较了本发明所述方法与显微计数法、叶绿素a分光光度法的数据准确性差异。

附图4为一种n-tio2纳米颗粒在可见光下对铜绿微囊藻的灭活测试结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

为测试一种tio2颗粒对栅藻的生长抑制作用，选用对数期浓度为10⁵ml/l的藻液进行生长抑制实验。tio2颗粒选用德固赛的p25，添加浓度为10、50、100、200mg/l，培养基为bg11的稀释液，与消毒后的纯水以1:9的比例混合，再与藻液混合后倒入100ml至锥形瓶中。培养温度25℃，0.5％的co2气体氛围，搅拌速率200r/min，光照强度4000lux，明暗比12：12，增殖剂孵育时间8h，孔板接种时将藻液稀释10倍。96h生长抑制率如附图3所示，抑制率最高的为100mg/l，达到62.56％，其次为200mg/l，为43.23％，50mg/l组抑制率最低只有21.78％，10mg/l则出现了促进藻类生长的结果。而当采用显微计数法时，结果显示10mg/l的p25抑制率即达到38.9％，50mg/l的抑制率则为57.86％，100mg/l则达到79.23％，200mg/l一组为94.56％；叶绿素a吸光度则与细胞增殖剂结果匹配，且抑制率更高，这可能是因为光合系统受到的抑制更大造成的。由于用光学显微镜只能计数上清液颗粒，而颗粒计数仪则无法识别死细胞，故计数法并不适用于纳米颗粒测试。

实施例2：

为测试一种可见光催化剂n-tio2纳米颗粒对铜绿微囊藻的光催化去除效果，选用对数期浓度10⁶ml/l的藻液进行实验，实验前离心洗涤去除培养基。n-tio2的添加浓度为1g/l，水体环境为纯水，实验前用酸碱调节ph至7.4，并设置相应的空白对照组。光源选择氙灯(波长420～700nm，辐照功率15mw/cm²)，照射时间12h，每3h取样一次，稀释100倍后接种至孔板，添加细胞增殖剂后孵育4h进行计数。需要说明的是，光照会促进细胞增殖，故光照开始细胞活性会突然增长，在处理一段时间后才会下降。以抑制率为评价标准，处理结果如附图4所示，6h内细胞活性仍呈上升趋势，随后开始下降，n-tio2则在9h才达到峰值，但远小于空白组，活性抑制率达到32.36％，21h后，相对空白组，n-tio2灭活率达到81.25％。