大黄鱼IFNc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大黄鱼ifnc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用。

背景技术：

干扰素（interferon，ifn）是一类能诱导脊椎动物细胞抗病毒状态，并在抗病毒防御中起重要作用的诱导性多基因家族细胞因子（robertsenb.theinterferonsystemofteleostfish[j].fishshellfishimmunol,2006,20(2):172-191）。硬骨鱼类作为低等脊椎动物也拥有相对完善的干扰素系统。鱼类ifn分为型ifn和型ifn两大类，其中i型ifn因其专一性地协调宿主抗病毒免疫而受到更多的关注（zhangyb,guijf.molecularregulationofinterferonantiviralresponseinfish[j].devcompimmunol,2012,38(2):193-202.）。根据成熟肽中半胱氨酸的数量及分布，鱼类i型ifn分为groupifn（成熟肽含2个保守的半胱氨酸）和groupifn（成熟肽含4个保守的半胱氨酸）。groupiifn包括ifna、ifnd、ifne和ifnh4个亚组，groupiiifn包括ifnb、ifnc和ifnf3个亚组(dingy,aoj,huangx,chenx.identificationoftwosubgroupsoftypeiifnsinperciformefishlargeyellowcroakerlarimichthyscroceaprovidesnovelinsightsintofunctionandregulationoffishtypeiifns[j].frontimmunol,2016,7:343.)。

最近的研究结果表明，除ifnd与ifnh外（groupiifn），鲈形目鱼如大西洋白姑鱼、鳜鱼等，还存在一种groupiiifn,ifnc（milnedj,campoverdec,andreekb,chenx,zouj,secombescj.thediscoveryandcomparativeexpressionanalysisofthreedistincttypeiinterferonsintheperciformfish,meagre(argyrosomusregius)[j].devcompimmunol,2018,84:123-132.laghariza,chensn,lil,huangb,ganz,zhouy,huohj,houj,niep.functional,signallingandtranscriptionaldifferencesofthreedistincttypeiifnsinaperciformfish,themandarinfishsinipercachuatsi.devcompimmunol.2018,84:94-108）。ifnc在各检测组织中呈组成型表达，在病毒或其类似物polyi:c诱导刺激后其表达量显著上调。大西洋白姑鱼ifnc可诱导自身及干扰素调节因子3和7的表达，并表现出明显地降低病毒滴度的作用（milnedj,campoverdec,andreekb,chenx,zouj,secombescj.thediscoveryandcomparativeexpressionanalysisofthreedistincttypeiinterferonsintheperciformfish,meagre(argyrosomusregius)[j].devcompimmunol,2018,84:123-132.）。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供可高效表达大黄鱼ifnc基因的大肠杆菌工程菌。

本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼ifnc基因的大肠杆菌表达产物及其制备方法。

本发明的目的之三在于提供大黄鱼ifnc重组蛋白的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大黄鱼ifnc基因的大肠杆菌工程菌，所述工程菌为大肠杆菌（escherichiacoli）bl21/pet-43.1a-ifnc，已于2018年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018697；中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。

一种大黄鱼ifnc基因大肠杆菌工程菌，重组表达了核苷酸序列如seqidno.1所示的基因。

大黄鱼ifnc基因大肠杆菌的表达产物，制备方法包括以下步骤：

（1）利用正向引物ifnc-f和反向引物ifnc-r，采用pcr技术扩增出编码第28位至第189位氨基酸的大黄鱼ifnc成熟肽基因片段；

（2）将步骤（1）得到的大黄鱼ifnc成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pet-43.1a，得到含大黄鱼ifnc基因片段的重组表达载体pet-43.1a-ifnc；

（3）将重组表达载体pet-43.1a-ifnc转化大肠杆菌bl21菌株，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定后，获得含有大黄鱼ifnc基因片段的大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌；同时，表达载体pet-43.1a转化大肠杆菌bl21菌株，获得的大肠杆菌bl21/pet-43.1a作为对照菌株；

（4）大肠杆菌pet-43.1a-ifnc工程菌在lb培养基中经终浓度0.1mmiptg诱导、16ºc振荡培养12小时，将培养物离心收集菌体，利用buffera重悬后，超声破碎，分别收集菌体裂解液上清和沉淀，经聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page分析后表明大黄鱼ifnc重组蛋白为可溶性表达；

（5）利用镍离子金属螯合亲和层析介质柱纯化该重组蛋白：离心收集大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌培养物中菌体，用冰预冷的pbs溶液洗涤三次，然后用buffera重悬菌体，置于冰水混合物中超声破碎15分钟，离心收集上清后上柱，4ºc结合30分钟，分别用预冷的bufferb和bufferc（洗柱，最后用bufferd洗脱，获得大黄鱼ifnc重组蛋白，纯化后的大黄鱼ifnc重组蛋白分别经buffer1、buffer2、buffer3进行3步透析，并最终透析至ph7.4的pbs缓冲液中。

所述buffera包括以下终浓度的试剂：20mmtris-hcl、150mmnacl、0.5%v/vtritonx-100和30mm咪唑，ph7.4；所述bufferb包括以下终浓度的试剂：20mmtris-hcl、150mmnacl、0.5%v/vtritonx-100、60mm咪唑，ph7.4；所述bufferc包括以下终浓度的试剂：20mmtris-hcl、150mmnacl、60mm咪唑，ph7.4；所述bufferd包括以下终浓度的试剂：20mmtris-hcl、500mmnacl、500mm咪唑，ph7.4；所述buffer1包括以下终浓度的试剂：20mmtris-hcl、150mmnacl、250mm咪唑，ph7.4；所述buffer2包括以下终浓度的试剂：20mmtris-hcl、150mmnacl、100mm咪唑，ph7.4；所述buffer3包括以下终浓度的试剂：20mmtris-hcl、150mmnacl，ph7.4。

本发明的优点在于：

本发明获得的大黄鱼ifnc基因的大肠杆菌表达产物为分子量约73kda的大黄鱼ifnc重组蛋白，该大黄鱼ifnc重组蛋白在终浓度为10ng/ml时，不仅在大黄鱼外周血细胞及头肾细胞中显著诱导自身及大黄鱼ifnd、ifnh的表达，还显著上调抗病毒基因mx1、pkr及isg15的表达。并且，该大黄鱼ifnc重组蛋白可明显地抑制石斑鱼虹彩病毒sgiv基因复制、抑制sgiv感染后的石斑鱼脾脏细胞的致病变效应，显示出良好的抗病毒效果，对于我国水产动物病毒病的防治具有广阔的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为纯化的大黄鱼ifnc重组蛋白的sds-page分析，其中m泳道为蛋白质分子量标准；1泳道为纯化的大黄鱼ifnc重组蛋白；箭头所指的是大黄鱼ifnc重组蛋白;2泳道是纯化的nus重组蛋白；kd（kilodalton)代表千道尔顿。

图2为大黄鱼ifnc重组蛋白对大黄鱼外周血白细胞中抗病毒蛋白基因表达的调节作用；10ng/ml的大黄鱼ifnc重组蛋白处理大黄鱼外周血白细胞2、4和8小时后，收集处理细胞并利用real-timepcr检测其中抗病毒蛋白mx1、pkr和isg15的基因表达水平，对照蛋白为10ng/ml的nus重组蛋白；上述基因的相对表达水平利用大黄鱼β-actin为内参标准化，其倍数变化为大黄鱼ifnc重组蛋白处理组中基因相对表达水平相对于nus重组蛋白处理组中基因相对表达水平的倍数。

图3为大黄鱼ifnc在石斑鱼脾脏细胞中抗石斑鱼虹彩病毒的功能；取10ng/ml的大黄鱼ifnc重组蛋白预处理石斑鱼脾脏细胞2小时后，接种石斑鱼虹彩病毒；感染后24小时，显微镜观察石斑鱼脾脏细胞的形态学变化；同时，于感染后12、24和48小时收集细胞培养物，并利用real-timepcr检测石斑鱼虹彩病毒基因mcp、vp19、vp136和icp18在石斑鱼脾脏细胞中的表达水平；对照蛋白为10ng/ml的nus重组蛋白；上述基因的相对表达水平利用石斑鱼β-actin为内参标准化，其倍数变化为大黄鱼ifnc重组蛋白处理组中基因相对表达水平相对于nus重组蛋白处理组中基因相对表达水平的倍数。每组实验重复三次，星号代表统计分析具有显著差异，^*p<0.05，^**p<0.01。

具体实施方式

实施例1一种大黄鱼ifnc基因cdna的获得

利用其他鱼类的ifnc序列及大黄鱼基因组(jrpu00000000)，经过序列比对后预测得到大黄鱼ifnc基因序列。根据预测的大黄鱼ifnc基因编码序列设计引物，用该引物进行聚合酶链反应得到大黄鱼ifnc基因的编码区序列。该序列全长570个核苷酸，编码一个由189个氨基酸组成的蛋白质。

所述大黄鱼ifnc基因cdna及其推断的氨基酸序列seqidno.1所示；其中，编码的第1-27位氨基酸为预测的大黄鱼ifnc信号肽。

实施例2一种大黄鱼ifnc基因cdna的获得

1.含大黄鱼ifnc基因的重组表达载体bl21/pet-43.1a-ifnc的构建

（1）大黄鱼ifnc成熟肽基因片段的pcr扩增：合成带有限制性核酸内切酶ecori位点的正向引物ifnc-f:ggaattctgtcagctggaaggagatc和带有hindiii位点的反向引物ifnc-r:cccaagcttttagtggacacctctcc；使用takara公司的primestar^®hsdnapolymerase按照说明书进行pcr扩增，pcr体系为：

pcr程序如下：

pcr扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：电压120伏，时间15分钟。使用凝胶成像仪观察，可见一条大小为570个核苷酸的条带，与预期相符，然后用omega公司胶回收试剂盒回收pcr扩增产物。

（2）酶切反应：回收的pcr扩增产物和大肠杆菌原核表达载体pet-43.1a分别进行限制性核酸内切酶ecori和hindiii双酶切，酶切反应体系：

酶切条件：37ºc反应3小时。酶切产物使用omega公司胶回收试剂盒进行回收。

（3）连接反应：使用takara公司t4dna连接酶连接双酶切后的pcr扩增产物和pet-43.1a载体，连接体系如下：

反应条件：16ºc反应4小时。

（4）连接产物转化invitrogen公司大肠杆菌e.colitop10感受态细胞，经菌落pcr筛选阳性克隆，扩大培养后，使用omega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒，并测序验证，从而获得了含大黄鱼ifnc基因片段的重组表达载体pet-43.1a-ifnc。

2.大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌的构建

将含有大黄鱼ifnc基因片段的重组表达质粒pet-43.1a-ifnc转化大肠杆菌bl21感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37ºc静置培养16小时，长出单菌落，得到含有大黄鱼ifnc基因的大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌。

培养基配方：

lb液体培养基：10g/l蛋白胨、5g/l酵母抽提物和10g/l氯化钠。

lb平板：10g/l蛋白胨、5g/l酵母抽提物、10g/l氯化钠和15g/l琼脂粉。

实施例3大黄鱼ifnc基因在大肠杆菌中表达及其表达产物纯化

1.大黄鱼ifnc重组蛋白的诱导表达及sds-page分析

将上述构建的大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌，挑取单菌落接种至5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37ºc，180转/分钟过夜振荡培养。第二天按体积比1:100比例接种于100ml含终浓度100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基的中，37ºc，180转/分钟振荡培养。待培养物od600至0.4~0.5时，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导蛋白表达，37℃继续振荡培养4小时，将培养物离心，收集菌体。

用10mlbuffera重悬收集的菌体，超声破碎10分钟，再将裂解液在4ºc，12000转/分钟，离心20分钟，收集裂解液上清，并用10mlbuffera重悬裂解液沉淀。菌体裂解液、菌体裂解液上清，菌体裂解液沉淀各取50μl，并加入等体积蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮10分钟，然后进行浓度为15%（w/v）的sds-page电泳。结果显示，对照菌株bl21/pet-43.1a的菌体裂解液中出现了一条约73kda左右的蛋白条带，为空载体pet-43.1a所表达的重组蛋白nus。而在大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌的菌体裂解液中则出现了一条约100kda左右的蛋白条带，说明了大黄鱼ifnc重组蛋白在大肠杆菌中得到了表达。同时发现大黄鱼ifnc重组蛋白主要存在于菌体裂解液上清中中，说明大黄鱼ifnc重组蛋白在大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌中主要为可溶性表达。基于此，后续采用可溶性蛋白纯化方法对大黄鱼ifnc重组蛋白进行纯化。

buffera：20mmtris-hcl、150mmnacl、0.5%v/vtritonx-100和30mm咪唑，ph7.4

2.亲和层析法纯化大黄鱼ifnc重组蛋白

参照invitrogen公司镍离子金属螯合亲和层析介质(ni-nta)推荐的方法进行重组蛋白的纯化：首先4ºc，5000转/分钟离心10分钟收集100mliptg诱导后的大肠杆菌bl21/pet-43.1a-ifnc工程菌菌体，用l0mlbuffera重悬菌体，超声破碎15分钟,然后4ºc，12000转/分钟，离心l0分钟收集菌体裂解液上清。

先用lml镍离子金属螯合亲和层析介质装柱，用5倍柱体积双蒸水洗柱，再加入5倍柱体积buffera平衡层析柱，液体流净后，将上述步骤中收集的上清上柱，4ºc孵育30分钟。用10mlbufferb和bufferc洗柱，按照顺序分别洗5次，洗去未结合的杂蛋白。再用1mlbufferc洗脱目的蛋白，重复收集5次。同时，通过相同的方法纯化nus重组蛋白。

bufferb：20mmtris-hcl、150mmnacl、0.5%tritonx-100和60mm咪唑，ph7.4。

bufferc：20mmtris-hcl、150mmnacl和60mm咪唑，ph7.4。

bufferd：20mmtris-hcl、500mmnacl和500mm咪唑，ph7.4。

3.大黄鱼ifnc重组蛋白透析

纯化后的大黄鱼ifnc重组蛋白分别经buffer1、buffer2、buffer3进行3步透析，并最终透析至pbs（ph7.4）中，每步不低于4小时。透析后，4ºc，12000转/分钟离心30分钟去除沉淀，同时通过相同的方法透析nus重组蛋白。取少量进行sds-page电泳分析，结果显示得到了纯度较高的大黄鱼ifnc重组蛋白及nus重组蛋白（图1），剩余的保存于-70ºc备用。

buffer1：20mmtris-hcl、150mmnacl、250mm咪唑，ph7.4。

buffer2：20mmtris-hcl、150mmnacl、100mm咪唑，ph7.4。

buffer3：20mmtris-hcl、150mmnacl，ph7.4。

实施例4大黄鱼ifnc重组蛋白对大黄鱼抗病毒蛋白诱导活性分析

（1）将大黄鱼外周血白细胞以1×10⁶个/ml的细胞密度接种于6孔细胞培养板，每孔2mlleibovitz'sl15培养基（gibico公司），于25ºc生化培养箱过夜培养。

（2）细胞培养基中加入大黄鱼ifnc重组蛋白至终浓度为10ng/ml，分别于处理后2、4和8小时收集细胞培养物，使用微量rna提取试剂盒（svtotalrnaisolationsystem，promega公司）提取细胞总rna，并按照逆转录酶m-mlv（rnaseh−，takara公司）说明书进行反转录pcr。同时，设置nus重组蛋白处理的细胞为阴性对照组。

（3）通过实时荧光定量pcr（real-timepcr）检测抗病毒蛋白基因如mx1、pkr和isg15在大黄鱼外周血白细胞中的表达水平。real-timepcr于mastercyclerepgradientrealplex4荧光定量pcr仪（eppendorf公司）进行反应，条件如下：95ºc预变性30s；95ºc变性5s，58ºc退火15s，72ºc延伸15s并获取荧光，40个循环。以β-actin作为内参基因。各基因引物如表1所示。实验结果采用2-^δδct法进行分析。

结果显示，在大黄鱼ifnc重组蛋白处理后，大黄鱼抗病毒蛋白mx1、pkr和isg15的基因表达水平在大黄鱼外周血细胞中被显著上调，并于诱导后4小时达到高峰，分别为对照组的17.3倍，5.4倍和7.5倍（图2）。

表1实时荧光定量pcr各基因引物表

实施例5大黄鱼ifnc重组蛋白的抗病毒活性分析

（1）将石斑鱼脾脏细胞以1×10⁶个/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板，每孔2mlleibovitz'sl15培养基（gibico公司），于28ºc生化培养箱培养18小时。

（2）细胞培养基中加入大黄鱼ifnc重组蛋白至终浓度为10ng/ml，静置孵育。2小时后，以感染复数为2的比例接种石斑鱼虹彩病毒。感染后24小时，显微镜观察石斑鱼脾脏细胞的细胞致病变效应。设置nus重组蛋白处理的细胞为阴性对照组。

（3）同时，于感染后12、24和48小时收集细胞培养物，使用微量rna提取试剂盒（svtotalrnaisolationsystem，promega公司）提取细胞总rna，并按照逆转录酶m-mlv（rnaseh−，takara公司）说明书进行反转录pcr。设置nus重组蛋白处理的细胞为阴性对照组。

（4）通过实时荧光定量pcr（real-timepcr）检测石斑鱼虹彩病毒基因mcp、vp19、vp136、和icp18在石斑鱼脾脏细胞中的表达水平。real-timepcr于mastercyclerepgradientrealplex4荧光定量pcr仪（eppendorf公司）进行反应，条件如下：95ºc预变性30s；95ºc变性5s，58ºc退火15s，72ºc延伸15s并获取荧光，40个循环。以石斑鱼β-actin作为内参基因。其倍数变化为大黄鱼ifnc重组蛋白处理组中基因相对表达水平相对于nus重组蛋白处理组中基因相对表达水平的倍数。每组实验重复三次，星号代表统计分析具有显著差异，^*p<0.05，^**p<0.01。各基因引物如表2所示。实验结果采用2-^δδct法进行分析。

表2实时荧光定量pcr各基因引物表

显微镜观查结果显示，大黄鱼ifnc重组蛋白可保护接种石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼脾脏细胞。表现为nus重组蛋白对照组大多数细胞已皱缩变圆，并出现明显地细胞空斑。而大黄鱼ifnc重组蛋白组细胞形态较为完整，无明显空斑（图3a）。real-timepcr结果显示在大黄鱼ifnc重组蛋白处理后，石斑鱼虹彩病毒基因mcp、vp19、vp136、和icp18的基因表达水平在石斑鱼脾脏细胞中被显著抑制（图3b）。表明大黄鱼ifnc重组蛋白具有明显的抗病毒功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>大黄鱼ifnc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用

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