一种富含多糖类的植物基因组DNA的提取方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种富含多糖类的植物基因组dna的提取方法。

背景技术：

近年来，由于分子生物学技术和测序技术的发展为科研工作者研究微生物基因组序列、次级代谢产物的合成机理等提供了良好的基础，而植物dna的获得则是这些工作的基础。

多糖作为植物细胞的结构组成物质和营养储存物质在植物细胞中大量存在。多糖是干扰植物dna提取的主要物质。多糖的许多理化性质与dna很相似，因此很难将他们分离。多糖与dna的结合形成的胶状物质不但影响实验的操作而且通过引起酶的活性中心改变或必须基团的改变而抑制许多酶的活性，严重影响分子生物学研究的下游工作。

随着测序技术的高速发展，pacificbioscience的smrt技术引起科研人员的广泛关注。该测序也是基于边合成边测序的原理，该项技术使用了zero-modewaveguide(zmw)(零级波导)。测序的过程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合(每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记)，被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。该技术对dna的质量和纯度要求特别高，如dna降解则造成数据量少，数据质量差，拼接效果不理想；dna纯度不高，有糖或者盐类等物质污染会造成聚合酶活性降低甚至失活，造成实验成本的浪费。

以往针对多糖类植物的基因组提取，只能使用试剂盒提取，但试剂盒昂贵，经过过柱也会有不同程度的打断，造成dna不完整。本实验方法简单易于操作，耗时短，成本较低，条带完整，能干净的去除多糖等杂质污染，适用于多种富含多糖类植物基因组的提取。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种dna提取纯度高，完整性好的富含多糖类的植物基因组dna的提取方法。

为了实现上述发明的目的，所采用的技术方案是：

一种富含多糖类的植物基因组dna的提取方法，包括如下步骤：

使用液氮在55-65hz的范围下研磨30-300s；

加入1ml预冷的ctab-freebuffer，20ul巯基乙醇，充分震荡混匀；

放置冰上2-3min，控制温度在4℃，以2000-5000rpm的速度，离心5-20分钟，弃掉上清；

使用pbs溶液进行清洗去除多糖类杂质；所使用的pbs溶液为1xpbs溶液：即10xpbs溶液(ambion，500ml/10xpbsbufferph7.4,货号:am9624)，用无菌水稀释10倍即可。

接入65℃预热的sds溶液500-1000ul，1％-4％巯基乙醇，混匀；

然后放入65℃水浴中20-60min，期间至少颠倒混匀3次；

待冷却后，加入等体积苯酚：氯仿，上下颠倒30-40次混匀；

以12000rpm的速度，离心5-15min，取上清，加入1-5ulrnasea，上下颠倒混匀，室温放置5-30min；

加入0.6-1倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10-20min或低温放置不低于一小时，10000-12000rpm离心10-30分钟，弃上清；

使用75％乙醇清洗一次，倒掉乙醇，待乙醇挥发干净，加入适量体积的灭菌水溶解。

在本发明的一个优选实施例中，所述预冷的ctab-freebuffer，按浓度计，包括如下组分：

0.2mtris-hcl；

0.05medta；

0.25mnacl；

4％pvp；

2％巯基乙醇，配置好后，放置在4℃的范围内预冷待用。

在本发明的一个优选实施例中，所述sds溶液，按浓度计，包括如下组分：

100mmtris-hcl(ph＝8.0)；

25mmedta(ph＝8.0)；

500mmnacl；

1-2％sds。

在本发明的一个优选实施例中，所述低温放置的温度不低于-80℃。

本发明的有益效果在于：

本发明的方法对于富有多糖类的植物基因具有更好的提取效果，在基因完整性及后续的分离度来说都比常规的ctab法或qiagendnaextractionkit提取更好。

附图说明：

图1为使用本实验方法进行提取的电泳结果图；

图2为使用常规ctab法提取的电泳结果图；

图3为使用qiagendnaextractionkit提取的电泳结果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。

将茉莉花瓣、栎树叶片、紫薇叶片、楸树叶片、丁香花样品按照如下步骤处理后上机：

1.加入1ml预冷的ctab-freebuffer，20ul巯基乙醇，充分震荡混匀；

2.放置冰上2-3min，4℃，4000rpm，离心10min，弃掉上清；

3.加入1mlpbs，混匀，4℃，4000rpm，离心10min，弃掉上清；

4.根据粘稠度选择再用pbs清洗一次，以达到对多糖类杂质的去除为准；

5.加入65℃预热的sds溶液700ul，10ul巯基乙醇，混匀；

6.放入65℃水浴中25min，期间至少颠倒混匀3次；

7.待冷却后，加入700ul苯酚：氯仿，上下颠倒30-40次混匀；

8.12000rpm，离心5min，取上清(约700ul)，加入2ulrnasea，上下颠倒混匀，室温放置5min；

9.加入700ul异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，12000rpm，离心10min；

10.加入1ml75％乙醇清洗，弃掉乙醇，待挥发干净之后，加入50ul无菌水溶解沉淀；

其中，预冷的ctab-freebuffer为：

0.2mtris-hcl；

0.05medta；

0.25mnacl；

4％pvp；

2％巯基乙醇(用时单管加)，配置好后，放置在4℃的范围内预冷待用。

sds溶液为：

100mmtris-hcl(ph＝8.0)；

25mmedta(ph＝8.0)；

500mmnacl；

1-2％sds。

最终的实验结果见图1，另外图2为使用常规ctab法提取的电泳结果图；图3为使用qiagendnaextractionkit提取的电泳结果图

图2从电泳图上看，电泳孔里杂质较多，且dna拖带降解严重。

图3，用过柱提取虽然电泳孔里杂质较少，但过柱会打断dna，有轻微的拖带降解。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种富含多糖类的植物基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：使用液氮研磨；加入预冷的CTAB‑free buffer，巯基乙醇，充分震荡混匀；放置冰上，控制温度在4℃，离心，弃掉上清；根据粘稠度再用PBS清洗一次，加入SDS溶液，巯基乙醇，混匀；然后水浴，期间颠倒混匀；待冷却后，加入等体积苯酚：氯仿，上下颠倒混匀；离心n，取上清，加入RNase A，上下颠倒混匀，室温放置；加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置或者低温放置，离心，弃上清，使用75％乙醇清洗，加入适量体积的灭菌水溶解。本发明的方法对于富有多糖类的植物基因具有更好的提取效果，在基因完整性及后续的纯度来说都比常规的方法提取更好。

技术研发人员：刘艳艳;马义峰;张洪波;孙子奎
受保护的技术使用者：上海派森诺生物科技股份有限公司
技术研发日：2018.11.21
技术公布日：2019.03.08