本发明涉及一种从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法，属于天然产物制备方法技术领域。
背景技术：
丹参为唇形科植物丹参salviamiltiorrhizabge.的干燥根和根茎，是我国传统医药中最常用的中药材之一。丹参归心、肝经，药性微寒，味苦，无毒，具有活血祛淤，痛经止痛，养心除烦，凉血消痈，用于胸痹心痛，脘腹胁痛，癥瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮瘍肿痛等证。丹参在临床上广泛用于治疗心血管系统疾病，具有扩张冠状动脉、增加冠血流量，改善微循环，降低心肌耗氧量，防治心肌缺血(心绞痛)和心肌梗塞等作用。
丹参主要的心血管活性成分是水溶性的酚酸性物质，其中丹酚酸b是丹参中最重要的有效活性成分，具有抗心肌缺血(心绞痛)、脑卒中、抗氧化、抗凝血、抗血栓及调节血脂，增加冠脉流量，预防和治疗动脉粥样硬化，抗炎等作用。丹酚酸b的分子式为：c36h30o16，分子量为718.61。
丹参的主要化学成分包括以丹酚酸b为代表的水溶性酚酸类和以丹参酮ⅱa为代表的脂溶性菲醌类。丹参的水溶性成分均具有酚酸性结构，在已知的成分中丹酚酸b是丹参水溶性成分中最主要的活性成分，含量也较高，由于它们均为水溶性成分，给提取与分离单一成分带来困难。
现有技术中，提取和分离丹酚酸b主要采用大孔树脂吸附法、盐析制备法以及微波制备法等方法。但是，这些方法所制备的丹酚酸b的纯度较低，产品的收率较低，或者是纯度虽然很高，但是操作复杂，工艺繁琐，不利于工业放大生产。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种操作和工艺简单、利于放大生产且丹酚酸b的纯度高、收率高的从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法。
本发明提供了一种从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，将预定质量的丹参药材在超声条件下水提2～4次，将每次水提的提取液进行合并得到混合提取液；步骤二，将混合提取液蒸发浓缩得到与丹参药材的预定质量的体积质量比为1:0.5～1:2的浓缩液；步骤三，将浓缩液用等体积的正丁醇萃取2～4次，得到萃取液；步骤四，在温度为0℃～70℃、压力为0.05mpa～0.1mpa的水浴条件下，对萃取液进行旋转蒸发，得到水溶性提取物；步骤五，将水溶性提取物用体积浓度为45％～55％的乙醇溶解后以条带状点样的方式点于层析用硅胶制备板上，晾干后置于层析缸内用展开剂展开，取出并晾干，置于紫外灯下254nm下检视，刮取紫色荧光色带，得到丹酚酸b粗品；步骤六，向丹酚酸b粗品中以质量体积比为1:2～1:4的比例加入体积浓度为45％～55％的乙醇，在0℃～30℃的条件下超声2～5min后进行过滤，重复2～4次，收集所有滤液进行真空减压，得到丹酚酸b纯品；步骤七，将丹酚酸b纯品用体积浓度为45％～55％的乙醇溶解，置于室温下结晶，得到丹酚酸b精品，其中，步骤一中，每次水提所使用的水的量与丹参药材的预定质量的体积质量比为12:1～8:1，每次水提的时间为30～50min，步骤五中，展开剂为正丁醇和醋酸乙酯以体积比为2:1～3:1的比例混和而成的混合溶液。
在本发明提供的从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤五、步骤六以及步骤七中，乙醇的体积浓度为50％。
在本发明提供的从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法中，还可以具有这样的特征：其中，展开剂中正丁醇和醋酸乙酯的体积比为5:2。
在本发明提供的从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法中，还可以具有这样的特征：其中，层析用硅胶制备板为gf254薄层层析硅胶板。
在本发明提供的从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，每次水提所使用的水的量与丹参药材的预定质量的体积质量比为10:1，每次水提的时间为40min。
在本发明提供的从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤六中，真空减压的温度为60℃，压力为0.08mpa。
在本发明提供的从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法中，还可以具有这样的特征：其中，丹参药材为新鲜丹参的根和根茎经过洗净、切片、晒干以及粉碎后得到的丹参粗粉。
本发明提供了一种从丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，将预定质量的丹参药材在超声条件下水提2～4次，将每次水提的提取液进行合并得到混合提取液；步骤二，将混合提取液蒸发浓缩得到与丹参药材的预定质量的体积质量比为1:0.5～1:2的浓缩液；步骤三，将浓缩液用等体积的正丁醇萃取2～4次，得到萃取液；步骤四，在温度为0℃～70℃、压力为0.05mpa～0.1mpa的水浴条件下，对萃取液进行旋转蒸发，得到水溶性提取物；步骤五，将水溶性提取物用体积浓度为45％～55％的乙醇溶解后过硅胶柱层析，用洗脱剂进行洗脱，在紫外灯下254nm下检视，收集得到丹酚酸b粗品；步骤六，将丹酚酸b粗品进行真空减压，得到丹酚酸b纯品；步骤七，将丹酚酸b纯品用体积浓度为45％～55％的乙醇溶解，置于室温下结晶，得到丹酚酸b精品，其中，步骤一中，每次水提所使用的水的量与丹参药材的预定质量的体积质量比为12:1～8：1，每次水提的时间为30～50min，步骤五中，洗脱剂为正丁醇和醋酸乙酯以体积比为2:1～3:1的比例混和而成的混合溶液。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法，因为包括步骤一～步骤七，其中通过步骤一和步骤二能够除去丹参中脂溶性如丹参酮iia等不溶于水的成分，使水中的丹酚酸b含量提高到30％左右；通过步骤三能够去溶解于水溶液中的糖、蛋白质等水溶性成分；通过步骤四能够使提取物中丹参酚酸b含量提高到50％左右；由于步骤四得到的水溶性提取物中含有丹参酸a、b、c、丹参素等数十种水溶性成分，如使用常规分离方法很难获得高纯度丹参酚酸b因此，我们通过步骤五根据水溶性丹酚酸b成分对硅胶薄层板吸附力的差异和能产生荧光的原理，并且利用对丹参酚酸总成分分离度不同的展开剂使点样于硅胶薄层板(gf254荧光板)上的成分分离，形成多条色带，刮取层析板上的紫色色带得到丹酚酸b粗品。然后通过步骤六利用45％～55％的乙醇对丹酚酸b粗品进行进一步提纯，此时获得96％的丹酚酸b，最后通过步骤七利用45％～55％的乙醇对丹酚酸b粗品进行重结晶后得到丹酚酸b精品。本方法工艺流程少、稳定、操作简便，丹酚酸b的含量明确，获得的丹酚酸b精品的纯度高达99％以上，得率为1％以上。
根据本发明所涉及的丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法，因为包括步骤一～步骤七，其中步骤五采用硅胶柱层析的方法来对水溶性提取物的乙醇溶液中的丹酚酸b进行分离，洗脱剂中正丁醇和醋酸乙酯的体积比为2:1～3:1，因此，本方法工艺流程少、稳定、操作简便，获得的丹酚酸b精品的纯度高达99％以上，得率为1％以上，适于工业化生产。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例对本发明丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法作具体阐述。
<实施例一>
本实施例中的丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法包括以下步骤：
步骤一，将新鲜丹参的根和根茎5kg，洗净、切片、晒干，置于粉碎机中粉碎为粗粉，约4.5kg。将预定质量(4.5kg)的丹参粗粉在超声条件下水提3次，每次水提所使用的水的量与丹参粗粉的预定质量(4.5kg)的体积质量比为10:1，即每次水提所使用的水的量为45l。每次水提的时间为40min。每次水提完成后进行过滤，收集滤液，将三次水提的滤液(提取液)进行合并得到混合提取液。本步骤的作用是去除丹参中脂溶性如丹参酮iia等不溶于水的成分。
步骤二，将混合提取液蒸发浓缩得到与丹参粗粉的预定质量(4.5kg)的体积质量比1:1的浓缩液(该过程中，提取液中的丹酚酸b的含量未受到明显影响)，即浓缩液的体积为4.5l。本步骤的作用是将丹酚酸b含量提高到30％左右。
步骤三，将浓缩液用等体积的正丁醇萃取3次，得到萃取液。本步骤的作用是除去溶解于水溶液中的糖、蛋白质等水溶性成分。
步骤四，在温度为0℃～70℃、压力为0.08mpa的水浴条件下，对萃取液进行旋转蒸发，回收正丁醇并得到水溶性提取物，该水溶性提取物为含有水溶性成分的提取物。本步骤的作用是使提取物中丹参酚酸b含量提高到50％左右。
步骤五，将水溶性提取物用体积浓度为50％的乙醇溶解后以条带状点样的方式点于gf254薄层层析硅胶板上，晾干后置于层析缸内用展开剂展开，展开后取出并晾干，在紫外灯下254nm下检视，刮取紫色荧光色带，收集得到丹酚酸b粗品。其中，展开剂为正丁醇和醋酸乙酯以体积比为2.5:1的比例混和而成的混合溶液。
步骤六，向丹酚酸b粗品中以质量体积比为1:3的比例加入体积浓度为50％的乙醇，在0℃～30℃的条件下超声3min后进行过滤，重复3次，收集所有滤液在温度为60℃、压力为0.08mpa的条件下进行真空减压，回收乙醇并得到丹酚酸b纯品。本步骤的作用是获得96％的丹酚酸b。
步骤七，将丹酚酸b纯品用体积浓度为50％的乙醇溶解，置于室温下析出结晶状的丹酚酸b精品。本步骤的作用是获得纯度99％以上的丹酚酸b。
本实施例中，丹酚酸b精品为白色结晶状，得率为1％以上。
<实施例二>
本实施例中的丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法包括以下步骤：
步骤一，将新鲜丹参的根和根茎4kg，洗净、切片、晒干，置于粉碎机中粉碎为粗粉，约3.5kg。将预定质量(3.5kg)的丹参粗粉在超声条件下水提3次，每次水提所使用的水的量与丹参粗粉的预定质量(3.5kg)的体积质量比为10:1，即每次水提所使用的水的量为35l。每次水提的时间为40min。每次水提完成后进行过滤，收集滤液，将三次水提的滤液(提取液)进行合并得到混合提取液。本步骤的作用是去除丹参中脂溶性如丹参酮iia等不溶于水的成分。
步骤二，将混合提取液蒸发浓缩得到与丹参粗粉的预定质量(3.5kg)的体积质量比1:1的浓缩液(该过程中，提取液中的丹酚酸b的含量未受到明显影响)，即浓缩液的体积为3.5l。本步骤的作用是将丹酚酸b含量提高到30％左右。
步骤三，将浓缩液用等体积的正丁醇萃取3次，得到萃取液。本步骤的作用是除去溶解于水溶液中的糖、蛋白质等水溶性成分。
步骤四，在温度为0℃～70℃、压力为0.08mpa的水浴条件下，对萃取液进行旋转蒸发，回收正丁醇并得到水溶性提取物，该水溶性提取物为含有水溶性成分的提取物。本步骤的作用是使提取物中丹参酚酸b含量提高到50％左右。
步骤五，将水溶性提取物用体积浓度为50％的乙醇溶解后以条带状点样的方式点于gf254薄层层析硅胶板上，晾干后置于层析缸内用展开剂展开，展开后取出并晾干，在紫外灯下254nm下检视，刮取紫色荧光色带，收集得到丹酚酸b粗品。其中，展开剂为正丁醇和醋酸乙酯以体积比为2.5:1的比例混和而成的混合溶液。
步骤六，向丹酚酸b粗品中以质量体积比为1:3的比例加入体积浓度为50％的乙醇，在0℃～30℃的条件下超声3min后进行过滤，重复3次，收集所有滤液在温度为60℃、压力为0.08mpa的条件下进行真空减压，回收乙醇并得到丹酚酸b纯品。本步骤的作用是获得96％的丹酚酸b。
步骤七，将丹酚酸b纯品用体积浓度为50％的乙醇溶解，置于室温下析出结晶状的丹酚酸b精品。本步骤的作用是获得纯度99％以上的丹酚酸b。
本实施例中，丹酚酸b精品为白色结晶状，得率为1％以上。
<实施例三>
本实施例分别对实施例一和实施例二的丹酚酸b纯品以及丹酚酸b精品进行了检测。
首先，分别将实施例一和实施例二的丹酚酸b纯品以及丹酚酸b对照品点于同一硅胶gf254板上，然后用展开剂进行展开。展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：5(体积比)。展开后取出，晾干，在紫外灯下检视，发现在同一位置显相同的紫色斑点。其中，丹酚酸b对照品购于中国食品药品检定研究院，批号为1108844-201411。说明实施例一和实施例二的丹酚酸b纯品确实为丹酚酸b。
然后，用hplc对丹酚酸b精品的纯度进行检测。hplc的具体条件为：c18柱250×4.0nm色谱柱，流动相为甲醇：乙腈：水：甲酸(30:10:59:1)，流速：1ml/min，检测波长为286nm，柱温为30℃。检测结果为实施例一和实施例二的丹酚酸b精品的纯度均大于99％。
实施例的作用与效果
根据上述实施例所涉及的丹参药材中制备高纯度丹酚酸b的方法，因为包括步骤一～步骤七，其中通过步骤一和步骤二能够除去丹参中脂溶性如丹参酮iia等不溶于水的成分，使水中的丹酚酸b含量提高到30％左右；通过步骤三能够去溶解于水溶液中的糖、蛋白质等水溶性成分；通过步骤四能够使提取物中丹参酚酸b含量提高到50％左右；由于步骤四得到的水溶性提取物中含有丹参酸a、b、c、丹参素等数十种水溶性成分，如使用常规分离方法很难获得高纯度丹参酚酸b因此，我们通过步骤五根据水溶性丹酚酸b成分对硅胶薄层板吸附力的差异和能产生荧光的原理，并且利用对丹参酚酸总成分分离度不同的展开剂使点样于硅胶薄层板(gf254荧光板)上的成分分离，形成多条色带，刮取层析板上的紫色色带得到丹酚酸b粗品。然后通过步骤六利用45％～55％的乙醇对丹酚酸b粗品进行进一步提纯，此时获得96％的丹酚酸b，最后通过步骤七利用45％～55％的乙醇对丹酚酸b粗品进行重结晶后得到丹酚酸b精品。本方法工艺流程少、稳定、操作简便，丹酚酸b的含量明确，获得的丹酚酸b精品的纯度高达99％以上，得率为1％以上。
进一步地，步骤五、步骤六以及步骤七中，使用的是乙醇，乙醇相比其它有机溶剂对人体的危害较小，更加安全，成本也比较低。乙醇的体积浓度为50％，在这一体积浓度下，一方面对丹酚酸b的溶解效果更好，另一方面，乙醇也较易除去。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
例如，在上述实施例中，步骤五为水溶性提取物用体积浓度为50％的乙醇溶解后以条带状点样的方式点于层析用硅胶制备板上，晾干后置于层析缸内用展开剂展开，取出并晾干，置于紫外灯下254nm下检视，刮取紫色荧光色带，得到丹酚酸b粗品。步骤六为向丹酚酸b粗品中以质量体积比为1:3的比例加入体积浓度为50％的乙醇，在0℃～30℃的条件下超声3min后进行过滤，重复3次，收集所有滤液进行真空减压，得到丹酚酸b纯品。
但在实际应用中，为了更好地进行工业应用，基于相同的分离原理，还可以采用如下形式：步骤五为将水溶性提取物用体积浓度为50％的乙醇溶解后过硅胶柱层析，用洗脱剂进行洗脱，在紫外灯下254nm下检视，收集得到丹酚酸b粗品，洗脱剂为正丁醇和醋酸乙酯以体积比为2.5:1的比例混和而成的混合溶液。步骤六为将所述丹酚酸b粗品进行真空减压，得到丹酚酸b纯品。其余步骤与上述实施例完全相同。
上述工艺流程少、稳定、操作简便，获得的丹酚酸b精品的纯度高达99％，得率为1％以上，更适于工业化生产。