一种马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株及其构建方法与应用与流程

本发明属于植物病毒生物学
技术领域：
，具体涉及一种马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株及其构建方法与应用。
背景技术：
：马铃薯卷叶病毒（potatoleafrollvirus，prlv）是最重要的马铃薯病毒性病害病原，在所有种植马铃薯的国家发生非常普遍。易感品种的产量损失可高达90%。该病毒在世界上最早发现于1916年，是造成马铃薯严重减产的病毒病害。此病害分布广泛，我国许多马铃薯品种感染这种病毒病，plrv可与pvx、pvy、pvs等病毒复合侵染，加重病情，严重减产，一般减产幅度20%-80%。减产的程度除多病原物符合侵染因素外，还取决于马铃薯品种和病毒株系以及栽培条件等。初期症状是流行季节由蚜虫传播感染造成的。上部叶片卷曲，尤其是小叶的基部。后期感染可能不会有症状，而且有些品种感染后并没有症状。高感品种的块茎薯肉中有明显的坏死组织。plrv不能通过接触传毒。可通过人工嫁接传毒。在自然条件下，仅由蚜虫传毒。田间最有效的传毒媒介是桃蚜，其他蚜虫如马铃薯长管蚜、百合新瘤蚜和茄沟无网蚜等均可将plrv传播到马铃薯上。蚜虫为持久性传毒。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株；第二目的在于提供所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株的构建方法；第三目的在于提供所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株的应用。本发明的第一目的是这样实现的，所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒（potatoleafrollvirus，prlv）毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2018年11月26日，保藏编号：cgmccno.16892。本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：a、采集仅带有马铃薯卷叶病毒的马铃薯品种会-2植株样品并保存；b、鉴定并应用马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、马铃薯s病毒、马铃薯a病毒、马铃薯t病毒、马铃薯v病毒、马铃薯m病毒、马铃薯奥古巴花叶病毒、马铃薯卷叶病毒抗体检测病样，获得仅含有马铃薯卷叶病毒的病样；c、应用马铃薯卷叶病毒外壳蛋白特异引物，通过聚合酶链式反应扩增并克隆病毒外壳蛋白基因核苷酸序列；d、带有马铃薯a病毒的会-2品种薯块材料消毒和培养；e、带有马铃薯a病毒的会-2品种组培苗保存；f、带有马铃薯a病毒的会-2品种组培苗应用。本发明的第三目的是这样实现的，所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株在检测马铃薯病毒中的应用。本发明从病株样品采集；电镜检测；病毒血清学检测；病毒、类病毒、植原体分子检测，筛选仅含有马铃薯卷叶病毒病样，选取病株薯块幼芽，通过组织培养方法获得马铃薯品种会-2prlv毒株，并应用于马铃薯病毒检测。附图说明图1prlv病毒粒子；图2应用马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株作为阳性检测结果图；图3带有prlv的会-2组培苗图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒（potatoleafrollvirus，prlv）毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏日：2018年11月26日，保藏编号：cgmccno.16892。本发明所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株的构建方法，包括以下步骤：a、采集仅带有马铃薯卷叶病毒的马铃薯品种会-2植株样品并保存；b、鉴定并应用马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、马铃薯s病毒、马铃薯a病毒、马铃薯t病毒、马铃薯v病毒、马铃薯m病毒、马铃薯奥古巴花叶病毒、马铃薯卷叶病毒抗体检测病样，获得仅含有马铃薯卷叶病毒的病样；c、应用马铃薯卷叶病毒外壳蛋白特异引物，通过聚合酶链式反应扩增并克隆病毒外壳蛋白基因核苷酸序列；d、带有马铃薯a病毒的会-2品种薯块材料消毒和培养；e、带有马铃薯a病毒的会-2品种组培苗保存；f、带有马铃薯a病毒的会-2品种组培苗应用。a步骤中所述的保存时保存于温度15~25℃、湿度40~60%的无光条件下保存并催芽。b步骤中所述的鉴定包括样品电镜负染色法和超薄切片法观察病毒的形态及病理学特征、样品与prlv（马铃薯卷叶病毒）抗体的血清学特征及样品总rna、应用聚合酶链式反应扩增马铃薯卷叶病毒（potatoleafrollvirus，prlv）外壳蛋白、比较分析核苷酸序列的分子生物学特征。所述的电镜负染色法包括以下步骤：a、将感病材料叶片切碎，加入固定液固定得到样品；b、将样品用载体网吸附3~5min得到吸附有病毒汁液的载体网，风干1~2min固定，然后进行染色，晾干后置于透射电子显微镜下观察。所述的固定液为质量百分浓度3%的戊二醛溶液。所述的染色是采用ph5.5、质量百分浓度2%的钼酸铵溶液染色2~3min。血清学检测包括以下步骤：a、将检测样品加入洗涤缓冲液研磨得到研磨液，取研磨液点至硝酸纤维素膜，同时点标准阳性对照和标准阴性对照，室温或37℃放置干燥10~20min；b、将硝酸纤维素膜移至装有封闭缓冲液的容器中，室温或37℃封闭50~70min，然后在封闭缓冲液中加入一抗，室温摇床摇匀，37℃培育50~70min或者4℃培育过夜，弃去一抗培育液，用洗涤缓冲液洗膜2~4次，每次4~6min，弃去洗涤缓冲液，然后加入封闭缓冲液，然后再封闭缓冲液中加入二抗，室温摇床摇匀，37℃培育50~70min或者4℃培育过夜，弃去二抗培育液，用洗涤缓冲液洗膜2~4次，每次4~6min，弃去洗涤缓冲液，采用显色缓冲液洗膜1~2次，每次4~6min，弃去显色缓冲液，加入显色液置于暗处5~10min显色，然后将膜移至清水中终止显色，分析并记录检测结果；其中，所述的洗涤缓冲液配方如下表：所述的封闭缓冲液配方是在洗涤缓冲液中按质量体积比百分数5%加入脱脂奶粉混匀制备得到；所述的显色缓冲液配方如下表：所述的显色液配制方法如下：每10ml显色缓冲液中加入66µl显色液a和33µl显色液b混匀；显色液a配方：0.5gnbt溶于10ml70%的二甲基甲酰胺；显色液b配方：0.5gbcip溶于10ml100%的二甲基甲酰胺。所述的分子检测包括以下步骤：马铃薯卷叶病毒检测步骤：取100mg马铃薯病叶，采用rneasyplantminikit程序提取植物总rna。以反向引物prlvcp2为起始引物，合成病毒基因组rna的cdna第一链。反转录体系20μl中含有5×反转录酶buffer4μl、10mmol/ldntp1μl、10μmol/l反向引物prlvcp2（5′-aagcttctatttggggttttgc-3′）1μl、rnasin0.5μl、mmlv逆转录酶1μl、rna模板5μl和depc水7.5μl。37℃放置30min。根据genbank/embl/ddbj数据库已报道的prlv序列设计合成外壳蛋白基因引物:prlvcp1（5′-gaattcatgagtacggtcgtg-3′）和prlvcp2。pcr反应体系为50μl,其中超纯水36.7μl,10×pcrbuffer5μl,10μmol/l上、下游引物各1μl,10mmol/ldntps1μl,反转录产物5μl,taq酶0.3μl。反应程序为94℃变性2min后,经30个循环扩增(94℃30s,50℃30s,72℃1min)后72℃延伸10min。1.0%(w/v)琼脂糖电泳。用qiaquickgelextrationkit回收目标条带,纯化产物克隆到pgemteasy载体中,转化大肠杆菌jm109感受态细胞。pcr法筛选阳性克隆。测序时随机选取5个阳性克隆,双向测序,序列分析采用blast和dnaman软件。c步骤中所述的马铃薯a病毒外壳蛋白特异引物为：prlv-cp1：5′-gaattcatgagtacggtcgtg-3′prlv-cp2：5′-aagcttctatttggggttttgc-3′。e步骤中所述的保存是在温度10~20℃，光照度8000~15000la的条件下保存。本发明所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株的应用为所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株在检测马铃薯病毒中的应用。本发明所述的马铃薯品种会-2中马铃薯卷叶病毒毒株的构建方法，具体操作如下：包括病株采集和保存、电镜检测、血清学检测、分子检测、带有prlv的会-2品种组培苗获得与保存；所述的含有马铃薯卷叶病毒cp基因pcr扩增引物根据注册报道的prlv分离物cp基因全序列设计，引物序列及其退火温度具体见下表：所述的病株采集和保存包括以下步骤：1）在不同田块采集马铃薯品种会-2中表现为叶片黄化、斑驳、皱缩、植株矮化单个病株，每一田块采集单株样品30个，同时采集病株薯块2个，详细记录采集地点、发病症状。2）用吸水纸包裹病株枝条或叶片，喷洒少许无菌水于吸水纸上，适当保湿，将样品放入适量大小的自封样品袋中，常温下保存，保证24小时内放入4℃冰箱，超过3天保存，放入-80℃超低温冰箱。薯块放置于无菌纸袋中，保存于15-25℃、50%湿度、无光条件下保存并催芽。所述的电镜检测包括以下步骤：本发明所用的电镜检测法为负染色法，也叫阴性反差染色法。这种染色法是用重金属盐类溶液与样品混合而使样品呈现出良好的反差，经这种方法染色的生物样品，在电镜下是暗背景下的亮物像，与通常的染色性质相反，所以称之为负染色。具体包括以下步骤：1）取少量感病材料用刀片将叶片切碎，直到叶片汁液渗出为止，加入少量3%的戊二醛固定；2）将透射软片200目载体铜网放在样品上吸附3～5min；3）取出吸附有病毒汁液的载体铜网，用滤纸吸干后，将吸附有病毒的一面朝上放置，风干1～2min；4）将载体铜网放入2%钼酸铵（ph5.5）中染色2～3min，晾干后置于透射电子显微镜下观察；5）染色后要及时观察或干燥保存；6）制备每个样品后，要将夹过载体铜网的镊子通过火焰或其他方法彻底清洁，防止不同被检材料相混。所述的血清学检测包括以下步骤：1）根据病样样品数量剪下硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜的一角剪去，用以指示膜方向。2）检测样品加入洗涤缓冲液研磨，移液器取2.5µl研磨液点至硝酸纤维膜方框中，同时点上标准阳性对照和标准阴性对照，室温放置或37℃放置至膜彻底干燥；3）将膜移至容器，加入封闭缓冲液，室温或37℃封闭1h；4）在封闭缓冲液中加入一抗（马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、马铃薯s病毒、马铃薯a病毒、马铃薯t病毒、马铃薯v病毒、马铃薯m病毒、马铃薯奥古巴花叶病毒、马铃薯卷叶病毒抗体），室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；5）弃去一抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；6）弃去洗涤缓冲液，加入封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入二抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h或4℃培育过夜；7）弃去二抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；8）弃去洗涤缓冲液，显色缓冲液洗膜1次，每次5min；9）弃去显色缓冲液，加入显色液黑暗处显色，充分显色后将膜移至清水中终止显色，分析并记录检测结果。所述的分子检测包括以下步骤：马铃薯卷叶病毒检测步骤：1）取100mg马铃薯病叶，采用rneasyplantminikit程序提取植物总rna。以反向引物prlvcp2为起始引物，合成病毒基因组rna的cdna第一链。反转录体系20μl中含有5×反转录酶buffer4μl、10mmol/ldntp1μl、10μmol/l反向引物prlvcp2（5′-aagcttctatttggggttttgc-3′）1μl、rnasin0.5μl、mmlv逆转录酶1μl、rna模板5μl和depc水7.5μl。37℃放置30min。2）根据genbank/embl/ddbj数据库已报道的prlv序列设计合成外壳蛋白基因引物:prlvcp1（5′-gaattcatgagtacggtcgtg-3′）和prlvcp2。pcr反应体系为50μl,其中超纯水36.7μl,10×pcrbuffer5μl,10μmol/l上、下游引物各1μl,10mmol/ldntps1μl,反转录产物5μl,taq酶0.3μl。反应程序为94℃变性2min后,经30个循环扩增(94℃30s,50℃30s,72℃1min)后72℃延伸10min。1.0%(w/v)琼脂糖电泳。用qiaquickgelextrationkit回收目标条带,纯化产物克隆到pgemteasy载体中,转化大肠杆菌jm109感受态细胞。pcr法筛选阳性克隆。测序时随机选取5个阳性克隆,双向测序,序列分析采用blast和dnaman软件。马铃薯纺锤块茎类病毒检测步骤：取100mg马铃薯病叶，采用rneasyplantminikit程序提取植物总rna。以反向引物pstvd-r为起始引物，合成病毒基因组rna的cdna第一链。反转录体系20μl中含有5×rtbuffer4μl、10mmol/ldntp1μl、10μmol/l反向引物pstvd-r（5′-aggaaccaactgcggttccaagg-3′）1μl、rnasin0.5μl、m-mlv逆转录酶1μl、rna模板5μl和depc水7.5μl。37℃放置30min。根据genbank/embl/ddbj数据库已报道的pstvd序列设计合成外壳蛋白基因引物:pstvd-r（5′-gaattcatgccgcccaaacc-3′）和pstvd-f（5′-cggaactaaactcgtggttc-3′）。pcr反应体系为50μl,其中超纯水36.2μl,10×pcrbuffer5μl,10μmol/l上、下游引物1μl,10mmol/ldntps1μl,反转录产物5μl,taq酶0.8μl。反应程序为94℃变性2min后,经30个循环扩增(94℃30x,52℃30x,72℃1min)后72℃延伸10min。1.0%(w/v)琼脂糖电泳。用qiaquickgelextrationkit回收目标条带,纯化产物克隆pgemteasy载体中,转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。pcr法筛选阳性克隆。测序时随机选取2个阳性克隆,双向测序,序列分析采用blast和dnaman软件。马铃薯植原体检测步骤：取100mg马铃薯病叶，采用ctab法提取植物总dna。根据genbank/embl/ddbj数据库已报道的马铃薯植原体核苷酸序列设计合成检测引物:r16mf1（5′-catgcaagtcgaacgga-3′），r16mr1（5′-cttaaccccaatcatcgac-3′），r16f2（5′-acgactgctaagactgg-3′），r16r2（5′–tgacggggttfgtacacaccgc-3′）。利用巢式扩增，一次扩增以植物总dna为模板，以r16mf1/r16mr1为引物；二次扩增以一次扩增产物为模板，以r16f2/r16r2为引物。pcr反应分阶段进行：94℃预变性处理5min，第一阶段变性温度94℃，1min，复性温度52℃，lmin，延伸温度72℃，2min，5个循环；第二阶段变性温度94℃，30s，复性温度52℃1min，延伸温度72℃，2min，25个循环；最后72℃延伸10min。1.0%(w/v)琼脂糖电泳。用qiaquickgelextrationkit回收目标条带,纯化产物克隆到pgemteasy载体中,转化大肠杆菌jm109感受态细胞。pcr法筛选阳性克隆。测序时随机选取5个阳性克隆,双向测序,序列分析采用blast和dnaman软件。所述的带有prlv的会-2品种组培苗获得与保存包括以下步骤：1）带毒材料的预处理：将带prlv马铃薯薯块的芽通过外植体消毒处理后，经过无菌培养繁殖长出更多的无菌苗，正常培养待无菌苗生根后，辅以变温处理（温度40℃/6小时和25℃/6小时，光照12小时/天，湿度70%以上）40~60天后，取苗尖进行茎尖剥离；2）带毒材料的消毒：从薯块上切取长1厘米左右的芽置于自来水上冲洗10~15分钟，用低浓度洗衣粉水漂洗1~2分钟，再置于自来水上冲洗1分钟，然后加入蒸馏水漂洗2次后置于超净工作台紫外灯下照射20分钟后进行无菌条件下的外植体消毒。先用75%乙醇浸泡20秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌3~5分钟，最后用无菌水冲洗3~5次，然后在40倍显微镜下用解剖刀与解剖针剥取带1个叶原基的生长点（直径约0.1~0.3毫米），以茎尖向上、切面向下的方向置于专用培养基中培养；3）马铃薯茎尖培养基的制备：茎尖培养通常选用ms培养基，推荐配方为：mx+naa0.05mg/l+6-ba0.1mg/l+ga30.2mg/l+泛酸钙0.2mg/l+糖30%+琼脂粉6~9g/l。本发明结果分析方法：标准阳性对照斑点变为红色、紫红色或黑色，标准阴性对照斑点不变色，表明实验过程正确无误。检测样品斑点变为红色、紫红色或黑色表明该样品带有prlv，计作阳性样品；检测样品斑点不变色表明该样品不带有prlv，计作阴性样品。下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：云南不同地区马铃薯植株上prlv的检测一、按说明书配制以下缓冲液及试剂：1.洗涤缓冲液配制：称取nacl8g，k2hpo40.2g，na2hpo4·12h2o7.2g，kcl0.2g溶解于1l蒸馏水中，调ph值至7.4，加0.1%吐温20混匀。2.封闭缓冲液配制：量取100ml洗涤缓冲液，加入5g脱脂奶粉搅拌混匀。3.对照试剂瓶配制：prlv标准阳性对照试剂瓶和prlv标准阴性对照试剂瓶分别加入2ml洗涤缓冲液混匀。4.配制1mol/ltris-hcl（ph9.5）：称取12gtris溶于100ml蒸馏水中搅拌混匀，调ph值至9.5。5.配制1mol/lnacl：称取5.8gnacl溶于100ml蒸馏水中搅拌混匀。6.配制1mol/lmgcl2：称取20.3gmgcl2溶于100ml蒸馏水中搅拌混匀。7.显色缓冲液配制：量取预先配制好的1mol/ltris-hcl（ph9.5）10ml，1mol/lnacl10ml，1mol/lmgcl20.5ml至200ml烧杯中，补足蒸馏水至100ml混匀。二、取54个不同地区、不同品种马铃薯叶片1～3g至加厚塑料自封袋中磨碎，均加入适量洗涤缓冲液混匀备用。三、剪8个方格的硝酸纤维素膜至于直径为5.5cm的培养皿中，移液器取2.5µl研磨液点至硝酸纤维膜方框中，同一样品上下个点一点，最后点上阳性对照和阴性对照，37℃放置至膜彻底干燥。四、加入5ml封闭缓冲液37℃封闭1h。五、在封闭缓冲液中加入1.0µl一抗（马铃薯卷叶病毒抗体），室温摇床摇匀，37℃培育1h。六、弃去一抗培育液，适量洗涤缓冲液水平摇床洗膜3次，每次5min。七、弃去洗涤缓冲液，加入5ml封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入0.7µl二抗，室温摇床摇匀，37℃培育1h。八、弃去二抗培育液，适量洗涤缓冲液水平摇床洗膜3次，每次5min。九、弃去洗涤缓冲液，适量显色缓冲液水平摇床洗膜1次，每次5min。十、配制显色液：量取5ml显色缓冲液，加入33µl显色液a和16.5µl显色液b混匀。十一、弃去显色缓冲液，加入5ml显色液在黑暗处显色，显色至阳性对照斑点变色，再延时10min后将膜转移到清水中终止显色。十二、结果分析：标准阳性对照斑点变为紫红色，标准阴性对照斑点不变色，表明实验过程正确无误。编号为45、46、47的检测样品斑点变为紫红色，表明样品带有prlv，计作阳性样品；其余样品斑点不变色表明该样品不带有prlv，计作阴性样品。检测结果见表1、表2和附图1、附图2；表1云南不同地区、不同品种马铃薯植株上prlv的检测样品记录表12345678910111213123456789101112131415161718192021222324252614151617181920212223242526272829303132333435363738392728293031323334353637383940414243444546474849505152404142434445464748495051525354阳性对照阳性对照阴性对照5354阳性对照阳性对照阴性对照表2云南不同地区、不同品种马铃薯植株上prlv的检测结果统计表样品编号检测结果样品编号检测结果样品编号检测结果样品编号检测结果1-16-31-46+2-17-32-47+3-18-33-48+4-19-34-49+5-20-35-50-6-21-36-51-7-22-37-52-8-23-38-53-9-24-39-54-10-25-40-阳性对照+11-26-41-阴性对照-12-27-42-13-28-43-14-29-44-15-30-45+注：表中“+”表示阳性，即检测样品中带有所测病毒；“—”表示阴性，即检测样品中不带有所测病毒。当前第1页12