一株高效钙矿化菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株高效钙矿化菌及其应用。

背景技术：

我国石质古迹文物资源丰富,含钙岩石是历史上遗存下来的大量石质文物中最常用的基质材料。石质文物饱受环境大气、酸雨、生物和地表温湿度变化等因素影响,导致石构件风化、分解等。目前，保护手段多采用无机或有机高分子材料来加固石质文物，但由于高分子材料的力学性能与原文物基材不匹配及保护材料老化等原因，经常会造成文物变色、硬壳形成和文物表层剥落等问题，且有些材料老化后很难去除，以至于使保护的文物受到二次破坏，严重时甚至会导致文物的毁灭。因此,寻找一种新型的有效的保护措施是保护石质文物的一个新思路。

自然界微生物种类繁多，有些微生物在石质文物的孔隙间能诱导碳酸钙结晶沉积并矿化。通过微生物诱导生成碳酸钙结晶沉积并矿化对风化的石质文物进行加固保护,是近年来国际石质文物保护修复领域研究的重点。这些碳酸钙结晶能与石质原材料成分相结合，从而对风化脆弱的石质文物进行加固。这种生物矿化加固法将克服有机和无机加固剂对文物产生的副作用，其诱导产物持久、成本低、对人和环境没有危害，满足文物保护的要求,在文物保护的实践应用中具有重要意义。利用微生物及生物技术进行文物保护将成为未来具环保型且行之有效的保护途径。

一般的化学加固剂渗透性都有一定的限制，且容易堵塞石质文物的孔隙，使内部的湿气不能出来，可能会进一步破坏文物；而细菌能够最大限度的渗透到石质文物内部中，诱导产生的碳酸钙结晶也不会堵塞石质的孔隙。

利用矿化微生物修复石质文物具有修复效果好、处理费用低、无二次污染等特点，但该修复技术的关键之一是获得高效钙离子矿化细菌。本发明主要介绍一种高效钙矿化细菌及其在文物修复上的应用。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种高效钙矿化菌及其应用，能够将钙离子矿化生成碳酸钙，从而应用于石质文物的修复。

技术方案：一株高效钙矿化菌，该细菌是蜡样芽孢杆菌emca1(bacilluscereusemca1)。

作为优选，(1)形态特征：该菌株为短杆状，成短或长链，菌体大小约为1.0-1.2×3.0-5.0μm，革兰氏染色阳性菌；(2)培养特征：该菌株在lb琼脂平板培养基上30℃培养24小时后，出现白色圆形菌落，直径约5-7mm，边缘不规则，菌落表面似蜡样；(3)菌株的诱导碳酸钙沉积特性：经过20天的培养，菌株可以将珊瑚砂溶液中的游离钙离子转化为碳酸钙沉淀，碳酸钙沉积实验中，钙离子浓度由36.9mg/l减少到7.19mg/l，珊瑚砂中方解石的比例由2%上升到20%；(4)菌株的16srdna基因序列如seqidno:1所示。

上述的高效钙矿化菌在文物修复上的应用。

有益效果：制备的菌株emca1具有较强的钙矿化性能，可将钙离子转化为碳酸钙，其晶体类型为稳定的方解石，可用于石质文物的修复。

附图说明

图1为菌株emca1在lb固体平板上培养24h的菌落图；

图2为菌株emca1革兰氏染色图（10×100）；

图3为矿化前后珊瑚砂的x射线衍射图谱；

图4为不同菌株钙矿化效果比较图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

所述菌株由em菌种中分离获得，具体方法如下：将em菌种1g加入9ml无菌水中，震荡摇匀，梯度稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6共6个浓度，将稀释液涂布于mrs平板（mrs固体培养基组成：k2hpo42.0g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，feso4•7h2o0.03g/l，柠檬酸铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，蛋白胨4.0g/l，牛肉膏4.0g/l，酵母膏2.0g/l，琼脂20g/l，ph=6.5-7.0）上，30℃恒温培养2-3天，直至长出菌落后，挑取不同形态的菌落到新鲜的mrs培养基上划线纯化3次，得到纯菌，将获得的菌种接入mrs液体培养基中，30℃，180r/min摇床培养24小时，将培养液与80wt.%甘油1比1混合后，保藏于-80℃冰箱。

实施例2

扩增与测序引物：

正向引物：27f5’-agagtttgatcctggctcag-3’

反向引物：1492r5’-ggttaccttgttacgactt-3’

提取emca1菌株的总dna，用引物27f和1492r进行pcr扩增该菌株的16srdna基因，用引物27f和1492r进行测序，该菌株的16srdna基因序列如seqidno:1所示。

在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上，用blast软件将emca1的16srdna基因序列与genbank的已知序列进行比较。结果表明菌株emca1与蜡样芽孢杆菌c5的16srdna基因(bacilluscereusstrainc516sribosomalrnagene,partialsequence)的序列同源性达到100％，证明所述菌株emca1为蜡样芽孢杆菌属。

实施例3

在100mlmrs培养基中加入20g/l的珊瑚砂，115℃，30min湿热灭菌后，按1%的比例接入菌株emca1，用不接菌的培养基作对照，在30℃，180r/min摇床培养20天后，取上清液用电感耦合等离子体发射光谱仪测定溶液中的钙离子浓度，并将珊瑚砂取出晾干后，用x射线衍射仪进行xrd分析。结果不接菌的对照溶液中钙离子浓度为36.9mg/l，珊瑚砂中方解石的比例为2%，而接入emca1的处理，溶液中钙离子浓度为7.19mg/l，珊瑚砂中方解石的比例为20%，可见，菌株emca1将溶液中的钙离子转化为了碳酸钙。

用同样的方法，同时接入其他菌株后，测定溶液中的钙离子浓度以及对珊瑚砂进行xrd分析，结果如图4，经过菌株emca1处理的样品，溶液中钙离子浓度下降最多，珊瑚砂中方解石的比例最高，表明菌株emca1的钙矿化能力最强。

综合上述实验结果，菌株emca1具有较强的钙矿化性能，可将钙离子转化为碳酸钙，其晶体类型为稳定的方解石，可用于石质文物的修复。

技术特征：

1.一株高效钙矿化菌，其特征在于，该细菌是蜡样芽孢杆菌emca1。

2.根据权利要求1所述的高效钙矿化菌，其特征在于，(1)形态特征：该菌株为短杆状，成短或长链，菌体大小约为1.0-1.2×3.0-5.0μm，革兰氏染色阳性菌；(2)培养特征：该菌株在lb琼脂平板培养基上30℃培养24小时后，出现白色圆形菌落，直径约5-7mm，边缘不规则，菌落表面似蜡样；(3)菌株的诱导碳酸钙沉积特性：经过20天的培养，菌株可以将珊瑚砂溶液中的游离钙离子转化为碳酸钙沉淀，碳酸钙沉积实验中，钙离子浓度由36.9mg/l减少到7.19mg/l，珊瑚砂中方解石的比例由2%上升到20%；(4)菌株的16srdna基因序列如seqidno:1所示。

3.如权利要求1或2所述的高效钙矿化菌在文物修复上的应用。

技术总结
一株高效钙矿化菌及其应用，属于微生物领域。本发明所述细菌是蜡样芽孢杆菌EMCa1。该菌株为短杆状，成短或长链，菌体大小约为1.0‑1.2×3.0‑5.0μm，革兰氏染色阳性菌，该菌株在LB琼脂平板培养基上30℃培养24小时后，出现白色圆形菌落，直径约5‑7mm，边缘不规则，菌落表面似蜡样，菌株的诱导碳酸钙沉积特性：经过20天的培养，菌株可以将珊瑚砂溶液中的游离钙离子转化为碳酸钙沉淀，碳酸钙沉积实验中，钙离子浓度由36.9mg/L减少到7.19mg/L，珊瑚砂中方解石的比例由2%上升到20%。本发明所述高效钙矿化菌及其应用，能够将钙离子矿化生成碳酸钙，从而应用于石质文物的修复。

技术研发人员：王一明;杨晓倩;林先贵
受保护的技术使用者：中国科学院南京土壤研究所
技术研发日：2019.02.21
技术公布日：2020.08.28