一种利用调控细胞周期转录因子提高发酵乙醇产率的方法与流程

本发明涉及一种利用调控细胞周期转录因子提高发酵乙醇产率的方法，属于生物能源技术开发技术领域。

背景技术：

酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)是目前燃料乙醇生产工艺中主要的发酵微生物。国内外利用玉米淀粉作为原料，通过酿酒酵母菌发酵生产燃料乙醇的技术已经非常成熟。自然筛选和诱变育种是传统的酿酒酵母菌种选育手段，但是通过它们提高菌株的乙醇发酵产量，已经基本到了极限。近年来，随着基因工程技术的快速发展，为提高酿酒酵母菌株的乙醇发酵水平提供了可能。通过转录因子基因的改造，可以同时改变受它调控的许多靶标基因的表达水平，从而获得来自多个基因改变造成的性状改变，有可能获得潜在的高产乙醇性状，这是通过单个基因的改变所不能达到的。

mbp1是一种dna结合蛋白(转录因子)，与swi6形成mbf复合物，构成mlu1细胞周期盒结合因子。mbf是在细胞周期的g1/s转变过程中调节基因表达的序列特异性转录因子。被mbf调控的基因涉及dna合成和dna修复以及g1周期蛋白基因。此外，转录因子swi4页可以与swi6形成类似的sbf复合物，构成swi4/6细胞周期盒结合因子。全基因组分析已经发现mbf和sbf复合物有100多个共同的靶标基因。然而，mbf和sbf复合物基因对于提高乙醇产率的功能尚未见报道。

技术实现要素：

本发明通过功能基因组学技术筛选，发现3个调控细胞周期的转录因子基因mbp1，swi4或者swi6的缺失，能够提高酿酒酵母菌发酵的乙醇得率。

本发明的第一个目的是提供一种提高酿酒酵母乙醇发酵得率的方法，所述方法是敲除调控细胞周期的转录因子基因mbp1，swi4或者swi6。

在本发明的一种实施方式中，所述基因mbp1的核苷酸序列如ncbi编号为:nm_001180115.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因swi4的核苷酸序列如ncbi编号为:nm_001179001.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因swi6的核苷酸序列如ncbi编号为:nm_001182069.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是mbp1缺失的酿酒酵母，购自invotrogen公司，编号为sc04106576_s1。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是swi6缺失的酿酒酵母，购自invotrogen公司，编号为sc04147446_s1。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是swi4缺失的酿酒酵母，购自invotrogen公司，编号为sc04118768_s1。

本发明的第二个目的是提供一种生产乙醇的方法，所述方法将缺失mbp1、swi6或swi4的菌株在发酵培养基中发酵36～60h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的前8～10h在160～220rpm培养，之后静置培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基成分按g/l计，含有：葡萄糖100，硫酸铵7.5，磷酸二氢钾3.5，七水硫酸镁0.75，酵母提取物0.2，组氨酸0.02，尿嘧啶0.02，亮氨酸0.1。

在本发明的一种实施方式中，发酵前将菌株在ypd培养基中活化。

本发明还要求保护调控细胞周期的转录因子基因mbp1，swi4和swi6在提高酿酒酵母菌的乙醇发酵生产效率方面的作用。

有益效果：本发明为提高乙醇发酵的生产效率提供了新的方法，本发明构建的高产乙醇的优良酿酒酵母工程菌株，经过52小时发酵，相比于野生型菌株(wt)，酒精发酵产率，提高了27.3～51.0％。

附图说明

图1为三个调控细胞周期的转录因子基因mbp1，swi4或者swi6的缺失菌株和野生型酿酒酵母菌株(wt)在发酵培养基中培养32小时(32h)和52小时(52h)后的产率(乙醇产量/菌体干重比)。*号表示每个基因缺失菌株和野生型菌株分别在32小时和52小时时间点的比较存在显著性差异。

具体实施方式

种子培养基按m/v计，含葡萄糖2％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，去离子水容，ph7.0。发酵培养基中各种成分的含量(g/l)为：葡萄糖100，硫酸铵7.5，磷酸二氢钾3.5，七水硫酸镁0.75，酵母提取物0.2，组氨酸0.02，尿嘧啶0.02，亮氨酸0.1，ph7.0。两种培养基均通过高压灭菌(115℃，20min)。

乙醇含量的测定方法：用高效液相色谱仪(hplc)检测发酵液中乙醇的含量，利用示差折光检测器进行检测。所用色谱柱是bio-rad有机酸柱，柱温为35℃，流动相是0.0275％(v/v)稀硫酸，流速为0.6ml/min。每个样品进样量为20μl，检测时间是25min。

乙醇对菌体得率按如下的公式计算：

式中y为乙醇产率，p为乙醇浓度，x为od值。

实施例1酿酒酵母菌的乙醇发酵

在ypd平板上划线活化实验菌株，30℃培养2天。每个菌株取一个单菌落接种30ml的ypd液体培养基，30℃，220r/min摇床培养16小时以上至饱和。按10％的比例把种子菌液接种到100ml的发酵培养基中，30℃，220r/min进行摇床培养8小时，然后转为静置培养发酵。

在接种后32小时和52小时两个发酵时间点，取1ml的菌体发酵液，测定菌体干重。另外取1ml的菌体发酵液，12000rpm离心5分钟，上清液取出用于液相测定其中的乙醇浓度。收集数据，并作出菌体干重、乙醇产量、乙醇产率图，如图1所示。经过52小时发酵，相比于野生型菌株(wt)，swi4、swi6和mbp1三个单基因缺失酿酒酵母菌株的酒精发酵产率，分别提高了51.0％、36.4％和27.3％。

对比例1：

dot6缺失的酿酒酵母购自invotrogen公司，编号为sc04118417_s1。

按照实施例1相同的方法对敲除dot6基因的酿酒酵母缺失菌进行培养、发酵。结果显示和野生型菌株(wt)相比，它的酒精发酵产率没有显著变化(图1)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种利用调控细胞周期转录因子提高发酵乙醇产率的方法，属于生物能源技术开发技术领域。本发明通过敲除调控细胞周期的转录因子基因MBP1，SWI4或者SWI6，为提高乙醇发酵的生产效率提供了新的方法，本发明构建的高产乙醇的优良酿酒酵母工程菌株，经过52小时发酵，相比于野生型菌株(WT)，酒精发酵产率，提高了27.3～51.0％。

技术研发人员：蒋伶活
受保护的技术使用者：山东理工大学
技术研发日：2019.04.03
技术公布日：2019.06.21