一种广东虫草原生质体制备及复苏方法与流程

本发明属于真菌的生物学领域，具体涉及一种广东虫草原生质体制备及复苏方法。

背景技术：

广东虫草(cordycepsguangdongensis)是2008年发表的新种，现已成功驯化并建立了成熟的子实体栽培体系。其子实体安全无毒，并已于2013年被国家卫生部正式批准为“新资源食品”(现更名为“新食品原料”)。实验发现，广东虫草子实体具有显著的药理功效，包括抗禽流感病毒、抗疲劳及延寿、治疗慢性肾衰竭、治疗慢性支气管炎、调节免疫等。前期研究还发现广东虫草含有丰富的代谢产物，包括多糖、脂肪酸、虫草酸、氨基酸、腺苷、微量元素等。目前通过基因组测序和分析，预测参与次生代谢物合成的基因簇有30个，对广东虫草活性物质的相关基因功能研究仍在进行。本发明通过建立广东虫草原生质体的制备及复苏体系，为实现广东虫草的基因功能研究及育种等奠定基础，有利于深入了解独特的代谢产物的合成途径及关键基因的功能，还有利于后期对广东虫草的遗传改造，以提高活性代谢物的产量，获得更多的药物先导化合物。

原生质体是指仅由原生质膜包裹的细胞部分，由于没有细胞壁，对诱导剂响应更为强烈，是进行基因改造工程的理想受体。另外，原生质体融合可以克服远源细胞间不亲和的问题，实现杂交及基因重组。原生质体制备的关键在于菌丝细胞壁的消化，影响原生质体产量及质量的因素众多，如：菌龄、消化酶及其体系、酶解时间、酶解温度、稳渗剂等(沈慧敏,李超,高利,等.原生质体法介导真菌遗传转化的研究进展[j].植物保护,2017,43(2):25-28)。不同真菌有适合自身的酶解体系及酶解条件，目前在虫草类真菌冬虫夏草、蛹虫草、蝉拟青霉、高雄山虫草中已有原生质体制备及复苏的研究，然而，广东虫草的原生质体制备方法尚未建立，而使用裂解酶及崩溃酶混合酶体系制备虫草原生质体的方法尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种广东虫草原生质体制备方法。

所述的广东虫草原生质体制备方法，包括以下步骤：

s1、菌丝体培养：将广东虫草菌丝体接种到ympt液体培养基中进行培养，获得广东虫草的幼嫩菌丝体；

s2、原生质体制备：将菌丝体依次用无菌水、kc缓冲液洗涤后，加入混合酶液进行酶解，获得含原生质体的混合液；

s3、原生质体纯化：将步骤s2获得的含原生质体的混合液进行纯化，得到广东虫草原生质体。

所述步骤s2的混合酶液中酶的总浓度为0.015g/ml，所述的混合酶为裂解酶和崩溃酶以质量比1:1组成。

所述的崩溃酶cas号为85186-71-6，购自sigma，所述的裂解酶lyophilizedpowder货号为l1412-5g，购自sigma。

所述步骤s2的酶解是在100rpm转速下进行酶解，酶解时间为5.5h，酶解温度为28℃。

所述的ympt液体培养基的配方为：每升培养基含有麦芽提取物6g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物6g，溶剂为去离子水。

所述的kc缓冲液的配方为：每300ml培养基含有kcl13.42g，cacl21.665g，溶剂为去离子水。

所述步骤s1的菌丝体培养是在120rpm，24℃培养12d。

所述步骤s3的纯化具体为：将步骤s2获得的含原生质体的混合液用已灭菌的双层擦镜纸过滤，取滤液，将滤液在4000rpm，4℃下离心15min，轻倒上清保留原生质体沉淀，用kc缓冲液洗涤原生质体沉淀，于4000rpm，4℃下离心15min，轻倒上清保留原生质体沉淀，得到广东虫草原生质体。

本发明的第二个目的是提供一种广东虫草原生质体复苏方法。

所述的广东虫草原生质体复苏方法，包括以下步骤：将利用上述的广东虫草原生质体制备方法制得的广东虫草原生质体加入kc缓冲液制成原生质体悬浮液，将悬浮液混合于tb3再生培养基中进行复苏培养，获得再生菌落。

所述的tb3再生培养基的配方为：每升培养基含有酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，低熔点琼脂糖15g，溶剂为蒸馏水。

所述的复苏培养是在24℃恒温培养10d。

本发明的有益效果是：首次建立了广东虫草原生质体制备及复苏体系，有利于广东虫草的后期遗传转化研究或原生质体融合等技术的实施，加快其遗传及育种等方面的研究速度，有助于推进其在保健食品和医药领域的研究应用进度，造福于社会。

附图说明

图1为广东虫草幼嫩菌丝体。

图2为广东虫草原生质体。

图3为广东虫草原生质体在tb3平板上复苏情况。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1广东虫草原生质体的制备

(1)培养基、kc缓冲液的制备：

ympt液体培养基：取麦芽提取物6g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物6g，混合，加去离子水定容至1l，121℃，灭菌20min。

tb3再生培养基：取酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，低熔点琼脂糖15g，加蒸馏水定容至1l，121℃灭菌20min。

kc缓冲液：取kcl13.42g，cacl21.665g，加去离子水定容至300ml，121℃灭菌20min。

(2)广东虫草原生质体的制备及复苏：

将广东虫草菌丝体接种至200mlympt液体培养基中，120rpm，24℃培养12d，获得广东虫草的幼嫩菌丝体(菌球)(图1)。配制酶液，在10mlkc缓冲液中加入裂解酶和崩溃酶的混合酶0.15g(裂解酶和崩溃酶质量比为1:1)，用0.22μm的一次性无菌过滤器过滤除菌备用。用移液器吸取广东虫草幼嫩菌球0.5g(约40颗)，无菌水洗一次，再用kc缓冲液洗一次。然后将准备好的酶液倒入幼嫩菌球中，100rpm，28℃，酶解5.5h，获得含原生质体的混合液。将混合液用已灭菌的双层擦镜纸过滤，取滤液，将滤液在4000rpm，4℃条件下离心15min，轻倒上清液，保留原生质体沉淀，再用kc缓冲液洗涤原生质体沉淀；继续在4000rpm，4℃条件下离心15min，轻倒上清液保留原生质体沉淀，用kc缓冲液稀释悬浮，镜检可见广东虫草原生质体(图2)。

将广东虫草原生质体用kc缓冲液稀释至10⁷个/ml，混匀于45ml低熔点的tb3复苏培养基中，倒板，做三个重复，置于24℃恒温培养箱中培养10d，可获得原生质体复苏长出的菌丝(图3)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种广东虫草原生质体制备及复苏方法。所述的制备方法包括菌丝体培养、原生质体制备、原生质体纯化等步骤，采用含有裂解酶和崩溃酶的混合酶体系对广东虫草的菌丝体进行酶解得到广东虫草的原生质体，并利用TB3复苏培养基对广东虫草原生质体进行复苏。本发明首次建立了广东虫草原生质体制备及复苏体系，有利于广东虫草的后期遗传转化研究或原生质体融合等技术的实施，加快其遗传及育种等方面的研究速度，有助于推进其在保健食品和医药领域的研究应用进度，造福于社会。

技术研发人员：邓旺秋;黄虹;李泰辉;张成花;李挺
受保护的技术使用者：广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
技术研发日：2019.04.18
技术公布日：2019.06.28