一种贴壁细胞复苏方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种贴壁细胞复苏方法。

背景技术：

细胞培养技术广泛渗透于科学研究领域，细胞低温冷冻贮存、复苏是细胞培养的常规工作。贴壁依赖型细胞即贴壁细胞在培养时需要贴附于培养器皿壁，因此对贴壁细胞进行复苏时，传统的方法是将解冻的细胞转移到事先准备好的离心管使细胞重悬、离心富集细胞、弃上清、加入新鲜培养基使细胞重悬、接种到培养瓶，具体来说，传统的方法一般包括以下步骤：

1)、取出冻存的细胞，将冻存管置于37℃的温水中，1分钟之内迅速融化；

2)、迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，1000转/分钟，离心3-5分钟；

3)、弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞；

4)、接种到培养瓶中，补足培养基；

5)、放入培养箱培养。

上述传统的方法通过离心去除死细胞和冻存细胞，操作耗时较长，尤其当接种瓶数较多时，劳动强度较大，污染概率增加。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种贴壁细胞复苏方法，针对贴壁细胞传统的复苏方式进行简化处理,在保证细胞活力的同时缩短处理时间、降低劳动强度。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种贴壁细胞复苏方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

s1.对贴壁细胞叠加外源刺激后，冻存细胞；

s2.取出冻存的贴壁细胞，将冻存管置于温水中，迅速融化；

s3.迅速将解冻后的细胞转移培养瓶中，加入新鲜培养基重悬细胞，静置于培养箱；

s4.复苏一段时间后，在显微镜下观察，大约70-80％细胞贴壁后，吸去培养基；

s5.加入新鲜培养基；

s6.放入培养箱培养。

进一步地，步骤s1的具体操作方法为：将贴壁细胞用酒精浓度1％的培养基培养10代后，用镅-241密封放射源进行贴壁照射，细胞培养至对数期，冻存。

进一步地，所述贴壁细胞为人正常肝细胞株l-02。

进一步地，步骤s1中放射源照射的剂量率为0.138gy/min。

进一步地，步骤s1中放射源的照射剂量为0.1-1gy。

进一步地，步骤s2中每个冻存管中细胞的总量约为1×10⁵个，体积为1.5ml。

进一步地，步骤s2中温水的温度为37℃。

进一步地，步骤s2中融化在1分钟之内完成。

进一步地，步骤s4中复苏时间为4-6小时。

本发明的有益效果在于：本发明所提供的方法，免去贴壁细胞传统复苏方式的离心步骤，简化了细胞贴壁细胞的复苏方式，缩短了处理时间、降低了劳动强度，同时还能保证复苏效果。

附图说明

图1为本发明实施例中提供的一种贴壁细胞复苏方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图与具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

如图1所示，一种贴壁细胞复苏方法，包括：

1)细胞刺激及冻存：将人正常肝细胞株l-02贴壁细胞用酒精浓度1％的培养基培养10代后，用镅-241密封放射源进行贴壁照射，剂量率0.138gy/min，照射剂量0.1gy，细胞培养至对数期，冻存。每管细胞总量约为1×10⁵个，体积1.5ml。

2)细胞复苏：取出冻存的贴壁细胞，将冻存管置于37℃的温水中，1分钟之内迅速融化；迅速将解冻后的细胞转移培养瓶中，加入新鲜培养基重悬细胞，静置于培养箱；复苏4-6h后，在显微镜下观察，大约70-80％细胞贴壁后，吸去培养基；加入新鲜培养基；放入培养箱培养。

实施例一：细胞活力测量及对照试验

取上述步骤1)中经冻存的细胞8管，其中4管用上述步骤2)所示的方法复苏，记为测试组；另外4管以传统的方法经解冻、离心富集、弃上清、加入新鲜培养等操作复苏，记为对照组。

将测试组和对照组的细胞用移液枪吹打混匀，制成2ml的单细胞悬液。取5μl单细胞悬液与5μl胎盼蓝染液混合，制成10μl混合液测量细胞活力。剩余单细胞悬液加入适量培养基，放入细胞培养箱继续培养。

细胞活力测量利用胎盘蓝进行，胎盘蓝是一种酸性蓝色染料，可透过死亡和垂死细胞的细胞膜，将其染成蓝色，而活细胞由于细胞膜的完整性，可将胎盘蓝排斥在外，因此透过过颜色变化可将活细胞和死细胞鉴别开来。

通过细胞计数仪测量两种复苏方式的活细胞数量和细胞总量，以活细胞比重为指标比较两种复苏方法的复苏效果。对照组和测试组的测试结果如表1所示。

表1两种复苏方法复苏后的总细胞数、活细胞数及活细胞比重(p＞0.05)

数据统计分析采用两样本方差检验，p<0.05说明复苏效果有区别，p＞0.05说明复苏效果一致。由表1可见，两种复苏方法活细胞比重无统计学差异，说明两种复苏方法可以达到同样的复苏效果，即本发明方法在降低劳动强度的同时还能保证复苏效果。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种贴壁细胞复苏方法，方法包括：取出冻存的贴壁细胞，将冻存管置于37℃的温水中，迅速融化；迅速将解冻后的细胞转移培养瓶中，加入新鲜培养基重悬细胞，静置于培养箱；复苏4‑6h后，在显微镜下观察，大约70‑80％细胞贴壁后，吸去培养基，加入新鲜培养基，放入培养箱培养。本发明所提供的方法，可改进传统的复苏方法，在保证细胞活力的同时，缩短了处理时间、降低了劳动强度。

技术研发人员：张慧芳;王婧洁;刘红艳;柴栋良;任越;杨彪;林海鹏;党旭红;原雅艺;李幼忱
受保护的技术使用者：中国辐射防护研究院
技术研发日：2019.05.16
技术公布日：2019.08.06