一种饥饿诱导镰刀菌产生分生孢子的方法与流程

本发明属于植物保护技术领域，具体为一种饥饿诱导镰刀菌产生分生孢子的方法。

背景技术：

镰刀菌是世界性农业生产中重要的病害之一，不仅能在土壤中越冬和越夏，而且寄主范围广，能够侵入粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物等100余种，通过破坏植物维管束疏导组织、细胞质膜系统、细胞核和核糖体结构等(刘开军等,2010)，引发植物萎蔫、根腐、茎腐、花腐和穗腐等多种病症，严重影响寄主植物的产量和品质；更为严重的是其分泌的毒素可以诱导人畜细胞发生凋亡，威胁人畜健康。

镰刀菌腐生能力强，以菌丝体或厚垣孢子在各种植物的残体中越冬，是翌年植物病害的主要初侵染源。分生孢子借气流、雨水、灌溉水的泼溅进行传播；通过幼根和茎基部的伤口侵入为害，病菌进入维管束系统后能马上堵塞导管，并产出有毒物质，扩散开来、且逐渐向上延展，导致病株叶片枯黄而死。农业生产中，明确致病菌是科学防治的重要前提，然而镰刀菌在室内分离和形态鉴定过程中，在多种培养基中以营养生长为主，不产生典型的分生孢子以供鉴定，因此对研究其致病性和准确防控带来一定难度。掌握镰刀菌产生分生孢子的方法是进行菌株科学鉴定和防治的先决条件。

研究者发现，在水琼脂培养基中通过外源添加康乃馨、石竹、绿豆粉或绿豆渣的方法，能够诱导镰刀菌大型分生孢子的产生，用于菌株的鉴定和底纹长期保存。但是利用这些方法不仅培养周期长，而且分子孢子数量相对较少且容易造成分生孢子形态变异，不宜于病原菌的鉴定和接种体的保存。

专利cn106434521a公开了一种诱导禾谷镰刀菌大量产生分生孢子的培养基及方法与流程。该方法主要是水琼脂培养基中添加绿豆粉或绿豆渣在诱导禾谷镰刀菌产孢上的应用。该诱导方法需要特制的培养基，在使用中受到一定限制。

因此需要研究一种成本低廉、操作简单、产生孢子量大、应用广泛的镰刀菌分生孢子诱导方法。

技术实现要素：

为解决以上现有问题，本发明提供一种饥饿诱导镰刀菌产生分生孢子的方法。本发明通过以下技术方案实现。

一种饥饿诱导镰刀菌产生分生孢子的方法，包括以下步骤：

(1)将从植物病株组织分离的镰刀菌菌丝体接种于pda(potatodextroseagar)培养基；

(2)25℃、12h/12h光暗交替条件下培养3～5d；

(3)利用打孔器从菌株边缘打孔，制备菌饼；

(4)无菌培养皿加入30ml无菌ddh2o，将菌饼浮于水面；

(5)25℃、12h/12h光暗交替条件下培养1～2d，有大量分生孢子产生。

优选的，步骤(1)所述的镰刀菌为禾谷镰刀菌(fusariumsp.)。

优选的，所述饥饿诱导方法为在无菌ddhh2o中进行培养。

优选的，步骤(4)所述的培养过程中菌饼正面向上置于装有无菌ddh2o的培养皿中。

更优选的，所述饥饿诱导后菌丝体产生孢子的情况是在显微镜下观察。

本发明的有益效果：

本发明一种饥饿诱导镰刀菌产生分生孢子的方法，整个操作过程简单、诱导周期短、成本低，还具有效率高的优点。

附图说明

图1为镰刀菌菌饼接种在pda培养基中培养4天后照片；

图2为镰刀菌菌饼接种在pda培养基中培养4天后菌丝在显微镜下观察照片；

图3为镰刀菌饥饿诱导后菌饼照片；

图4为镰刀菌饥饿诱导后菌丝在显微镜下观察照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作更为详细、完整的说明。

一种饥饿诱导镰刀菌产生分生孢子的方法，包括一下步骤：

(1)将组织分离的菌丝体接种于pda(potatodextroseagar)培养基；

(2)25℃、12h/12h光暗交替条件下培养3～5d；

(3)利用打孔器从菌株边缘打孔，制备菌饼；

(4)无菌培养皿加入30ml无菌ddh2o，将菌饼正面向上浮于水面；

(5)25℃、12h/12h光暗交替条件下培养1～2d，显微镜下观察有大量分生孢子产生。

在实施例1中，将从黄芪根腐病病害组织分离的镰刀菌(fusariumsp.)菌饼接种在pda培养基中培养4天作为对比项，与饥饿诱导培养的菌丝体进行对比(培养结果参见图1、2)。饥饿诱导的具体实施方式为，将pda培养基中生长3天的菌丝体制成菌饼，正面向上浮于无菌ddh2o，25℃培养1天后结果见图3，在显微镜下观察菌丝产生分生孢子的情况，参见图4，结果显示菌丝体有大量分生孢子产生，而对比项即没有饥饿诱导、直接在pda培养基中培养4天的结果则表明菌丝没有分生孢子产生。由此可以看出饥饿诱导是一种切实有效的镰刀菌菌丝分生孢子产生的诱导方法。

显然，所描述的实施例仅是本发明的个别实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施，都属于本发明的保护范围。

技术特征：

技术总结
本发明公开一种饥饿诱导镰刀菌产生分生孢子的方法，包括以下步骤：(1)将组织分离的镰刀菌菌丝体接种于PDA(Potato Dextrose Agar)培养基；(2)25℃、12h/12h光暗交替条件下培养3～5d。(3)利用打孔器从菌株边缘打孔，制备菌饼；(4)无菌培养皿加入30mL无菌ddH2O，将菌饼浮于水面；(5)25℃、12h/12h光暗交替条件下培养1～2d，有大量分生孢子产生。其中，所述饥饿诱导方法为在无菌ddHH2O中进行培养；步骤(4)所述的培养过程中菌饼正面向上置于装有无菌ddH2O的培养皿中；所述饥饿诱导后菌丝体产生孢子的情况是在显微镜下观察。本发明诱导分生孢子的方法，整个操作过程简单、诱导周期短、成本低，还具有效率高的优点。

技术研发人员：郭力维;段润晴;何霞红;朱书生;杨敏;黄慧川;刘屹湘;邓维萍;杜飞;梅馨月;朱有勇
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：2019.06.25
技术公布日：2019.09.27