一株高效除磷酵母菌及其在生活污水处理中的应用的制作方法

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株高效除磷酵母菌及其在生活污水处理中的应用。

背景技术：

磷是一种所有生命（动物、植物、微生物）赖以生存的微量元素，是构成菌体核蛋白、核酸等物质的重要组成成分；在自然界中，磷主要以磷酸盐的形式存在，约三分之二的磷矿用于磷肥，还用于制造磷酸、杀虫剂、洗衣粉等；但是，磷是一种单向循环的不可回收资源，它的消耗将造成严重的流失，甚至比水和石油更加宝贵；据统计，全球磷矿石年开采量约一亿吨，2035年将达到全球磷矿石的产值巅峰，之后将面临磷资源短缺困境；同时，随着工业企业的不断发展，大量含磷废水排入天然水体，破坏水体的自净能力，导致严重的水华、赤潮等现象的发生，破坏水体及水生态环境；因此，同步实现废水除磷与磷回收成为解决当前磷资源形式的突破口。

生物除磷方法以投资成本低、无需投加化学药剂、无二次污染等优势，成为目前应用最广泛的废水除磷方式；在以往的研究中，除磷生物大多为聚磷菌，利用聚磷菌在好氧条件下过度吸磷的原理，通过排出剩余污泥的形式达到废水除磷的目的；但是聚磷菌反应条件较为复杂，需要严格控制好氧/厌氧交替环境。

酵母菌是磷的地球化学循环过程中最重要的生物因子之一，但因为酵母菌在活性污泥占的比例较小，因此在污水处理系统中酵母菌研究长期以来被忽视；研究酵母菌在不同环境因子条件下的除磷性能，优化反应条件，以提升酵母菌除磷效率，达到高校除磷的目的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株高效除磷酵母菌及其在生活污水处理中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一株高效除磷酵母菌，属于褶皱假丝酵母，该菌株命名为candidarugosabl3。

上述褶皱假丝酵母菌bl3的菌落形态为：在ypd培养基上呈淡黄色扁平蜡状，中间有乳白色丝状连接；对其进行单菌落培养，单菌落形成时呈乳白色圆形，2~3mm，表面光滑蜡状，不透明，粘稠易挑起；成熟后期，菌落中间凹陷，四周隆起，有浓烈的酒香味。

上述褶皱假丝酵母菌bl3的26srdna的基因序列特征为：26srdna基因序列长度为528bp，采用blast分析法将26srdna序列与genbank数据库进行比对分析，发现该菌株与candidarugosa的亲缘关系最接近，同源性高达100％，褶皱假丝酵母菌bl3的系统发育进化树见图1。

采用上述褶皱假丝酵母菌bl3对实际生活污水进行处理结果发现：在od600=0.2±0.02，在ph为5，温度为25℃条件下，摇床震荡（220r/min）好氧培养条件下，本发明菌株对磷的去除率达84.9％，对氨氮的去除率达39.5%，对cod的去除率达78.3%。

本发明的有益效果如下：本发明从生活污水处理工艺a/o交替曝气生物滤池中分离出褶皱假丝酵母菌bl3，该菌在好氧条件下能实现高效除磷，且培养60h后，仍无释磷现象，可以作为除磷高效生物菌剂应用于生活污水处理中，对污水具有良好的去污能力，能有效提高生活污水处理工艺的处理效率和稳定性。本发明拓宽了人们对褶皱假丝酵母菌（candidarugosa）在其功能方面的应用研究思路，并为生活污水的高效除磷提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。

附图说明

图1是candidarugosabl3系统发育树；

图2是candidarugosabl3生长及除磷性能与ph的变化关系图；

图3是candidarugosabl3生长及除磷性能与温度的变化关系图；

图4是candidarugosabl3生长及除磷性能与碳源种类关系图；

图5是candidarugosabl3的生长曲线图；

图6是candidarugosabl3在生活污水中的除磷性能图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。

实例1：菌株的分离、筛选和鉴定。

（一）材料准备：

1.从运行良好的a/o交替生物膜系统中采集颗粒滤料，并制成菌悬液，采用梯度稀释法将稀释液接种至酵母菌筛选培养基上，进行酵母菌的涂布分离；用接种环挑取不同种类的酵母菌进行划线纯化；最后将纯化好的酵母菌保藏于-86℃超低温冰箱中；

2．培养基

酵母菌筛选培养基（1l）：20g蛋白胨，20g葡萄糖，10g酵母膏，15~20g琼脂粉，15ug/ml 的链霉素，60mg/l的氯霉素，121℃灭菌15min；

ypd固体培养基（1l）：20g蛋白胨，20g葡萄糖，10g酵母膏，15~20g琼脂粉，121℃灭菌15min；

ypd液体培养基（1l）：20g蛋白胨，20g葡萄糖，10g酵母膏，121℃灭菌15min；

合成废水培养基（1l）：0.3g葡萄糖、0.15g乙酸钠、0.15g蛋白胨、0.01g酵母粉、0.045gkh2po4、0.16gnh4cl、0.05gnacl、mgcl20.01g、feso40.01g；

3．实验仪器和设备

杰瑞尔shz-82a气浴恒温振荡器，电热恒温培养箱，三洋全自动高压灭菌锅，uv-1750紫外可见分光光度计—上海棱光技术有限公司，ph计等，超净工作台，pcr仪，电泳仪及电泳槽，凝胶紫外观测仪。

（二）高效除磷菌株的筛选：

1．将在超低温冰箱内保存的菌种划线培养于ypd培养基上，28℃条件下培养3d，挑取清晰、易于挑取的单菌落，接种于ypd液体培养基内，28℃、220rpm条件下培养12h，制成种子液；

用移液枪取16ml酵母菌种子液置于离心管中，20℃、5000rpm条件下离心8min，弃上清液，用无菌水冲洗离心管壁两次，弃冲洗液，再次往离心管内加无菌水并摇匀，相同条件下重复离心一次，弃上清液，用移液枪往离心管内加1ml无菌水，摇匀，倒入废水培养基内，接种成功；

2．将接种成功后的废水培养基于28℃、220rpm恒温摇床中培养3~5天，每隔4小时进行取样测其od600值，并计算除磷情况，综合其生长情况以及除磷效能，得到一株高效除磷酵母菌株。

（三）菌株特性及鉴定

1.菌落形态特征以及生理生化特性：将上述得到的高效除磷酵母菌命名为bl3，对菌株bl3的菌落形态进行了仔细观察，该菌落形态：菌落呈淡黄色扁平蜡状，中间有乳白色丝状连接，单菌落呈乳白色圆形，表面光滑蜡状，不透明，粘稠易挑起，有浓烈的酒香味；菌株bl3的主要生化特征：液体培养时有少许沉淀，能形成菌环，形成圆形子囊孢子，无产酯产酸现象，既能形成假菌丝又能形成真菌丝；菌体大小2~3mm；

2．对于菌株bl3的26srdna分子鉴定：根据天根酵母基因组dna提取试剂盒说明书提取酵母基因组并进行pcr扩增，后委托中国生工（上海）生物技术有限公司进行测序，测序后得到菌株bl3的长度为528的基因序列；利用blast软件，将测得的基因序列与genbank数据库的序列进行同源性比对：与褶皱假丝酵母(candidarugosa)100%的相似度，推测该菌为candidarugosa；登录号为ky107668.1；综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，该菌株命名为candidarugosabl3，candidarugosabl3的系统发育进化树见图1；具体基因序列如下所示：

1ggcatatcaataagcggaggaaaagaaaccaaccgggattgcctcagtaa

51cggcgagtgaagcggcaacagctcaaatttgaaagcccgcgggcgttgta

101atttgcaggcggatgttttggggcgggcgctgtctacgttccttggaaca

151ggacgccgcagagggtgagagccccgtgcgatggcgcctccaaccgcgta

201aaactccgccgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaagtgggtg

251gtaaattccatctaaagctaaatactggcgagagaccgatagcgaacaag

301tacagtgatggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcac

351gtgaaattgttgaaagggaagggtatgcgattagcggccagcaggaggtg

401ccttctcgtgaaaaggccgtgcaccgtcttcggacaccgtgcgcggagat

451ggcgagggggcgcctgaggtctgcgactcgaggttgctggcgtaatgatt

501gcataccacccgtcttgaaacacggacc

本发明从传统的生活污水处理工艺a/o交替曝气生物滤池中分离出酵母菌bl3，发现其有较强的除磷能力，无需严格的溶解氧条件，在好氧状态下除磷率可达84%，且无释磷现象；该菌株命名为candidarugosabl3，登录号ky107668.1；本发明拓宽了人们对candidarugosa在其功能方面的应用研究思路，并为生活污水的高效脱氮除磷提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。

实例2本发明中菌株candidarugosabl3的培养。

（一）本发明中菌株的培养条件优化

①不同ph

在废水培养基灭菌之前使用盐酸和氢氧化钠分别调节ph值为3、4、5、6、7、8、9（3个平行样），取16ml菌悬液接种，调整od600＝0.2±0.02，摇床(28℃、220r/min)震荡培养60h，测定od600及上清液中po4^3--p浓度，计算除磷率，结果见图2；由图2可知，本发明菌株在ph为3～9范围内od600、除磷率逐步上升，当ph值为3时,菌株bl3的磷酸盐去除率只有40.6%；ph值为5~7之间时，菌株bl3的磷酸盐去除率保持在75%以上，最高值出现在ph=5时为83.8%。当ph达到9时,菌株bl3的磷酸盐去除率下降到68.6%；由以上结果可知,菌株bl3的适宜除磷ph范围为5~7，最佳ph为5；

②不同温度

取16ml菌悬液分别接种于350ml合成废水培养基中，调整od600＝0.2±0.02，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃条件下，摇床(220r/min)振荡培养60h，测定od600及上清液中po4^3--p的浓度，计算除磷率，结果见图3。由图3可知，菌株在好氧培养条件下，在10～35℃范围内od600、除磷率逐步上升，而磷酸盐去除率在25℃时达到最高点，去除率为75.7％，当温度大于25℃时磷酸盐去除率逐渐降低至69.8%；这可能是因为过高的温度使菌株bl3中某些合成poly-p颗粒的酶系活性降低；本发明菌株candidarugosabl3的适宜生长温度在20～35℃之间，最佳生长温度是25℃；

③不同碳源

分别以葡萄糖、乙酸钠、淀粉、甲醇、混合碳源（葡萄糖+乙酸钠）为唯一碳源，接种于350ml不含碳源的生活污水培养基，调整od600＝0.2±0.02，28℃条件下，摇床(220r/min)振荡培养60h，测定od600及上清液中po4^3--p浓度，计算除磷率，结果见图4；由图4可知，当碳源为混合碳源时本发明菌株candidarugosabl3除磷效能最佳，除磷率为54.6％；其次是葡萄糖，除磷率为50.6％；菌株在以淀粉为唯一碳源的培养基中生长最差，除磷率仅为5.67％。

（二）本发明中菌株的生长特性

挑取1环candidarugosabl3接种于含有150mlypd液体培养基的锥形瓶中，于28℃、220rpm恒温摇床中培养3d，每隔4h进行取样，涂布培养测其活菌数，结果如图5所示；由图5可知，菌株bl3的生长曲线比较典型，前6h为适应期，6-16h为对数期，16-56h为稳定期，56h之后进入衰亡期。活菌数随时间变化方程：

n=14.68885+15.37056/{1+exp[(t-0.23666)/0.2423]}r²=0.98998

上式中n为菌落数，单位为109cfu；t为时间，单位为h。

实例3本发明中菌株candidarugosabl3在污水处理中的应用：取山东某高校中水站调节池污水（cod浓度为400mg/l，磷浓度为11mg/l，氨氮浓度为44mg/l），进行废水除磷试验，具体步骤如下：取350ml实际污水（已灭菌）于500ml锥形瓶中，调整od600=0.2±0.02，在ph为5，温度为25℃条件下，摇床震荡好氧培养，震荡频率为220r/min；分别于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h取检测水样，离心后取上清液，测量上清液中正磷、氨氮、cod的浓度变化，结果见图6；由图6可见好氧培养过程中12h内本发明菌株对磷的去除率达84.9%，对氨氮的去除率达39.5%，对cod的去除率达78.3%。