可敲低SRC-1基因表达的siRNA及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种可敲低src-1基因表达的sirna及其应用。
背景技术：
：脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占原发性恶性脑肿瘤的80％，根据欧洲神经肿瘤协会（eano）统计，全世界脑胶质瘤每年发生率约为6/100,000。脑胶质母细胞瘤（gbm）是恶性程度最高的脑胶质瘤（世界卫生组织who，iv级，2007），占颅内原发肿瘤的16%,占脑胶质瘤的50%，确诊后的5年生存率小于5%。gbm重要的生物学特征是侵袭性生长，易复发和肿瘤组织内部细胞异质性。目前临床上普遍采用包括手术切除、标准剂量放射治疗（60gy）和替莫唑胺（tmz）同步化学治疗在内的综合治疗策略。但是因手术难以切除全部肿瘤、放化疗易出现耐受以及对替莫唑胺不敏感等原因，使这种治疗策略仍然有很大的局限性，患者的生存期和生存质量没有显著提高。src-1（类固醇受体共活化因子），也称核受体共活化因子，位于人的2号染色体（p23）和小鼠第12号染色体（a-3），其orf区基因dna序列及氨基酸序列均为已知。src-1属于p160家族，是一种转录共激活因子，p160家族还包含src-2（tif2或grip1）和src-3（aib1或actr）。这些共活化因子的作用主要是通过与核受体（雌激素受体和孕激素受体）以及其他转录因子（ap-1,nf-κb,β-catenin,ets-2,hoxc11和pea3）相互作用来促进转录。作为基因表达的重要调节因子，src-1参与调节多种机体的正常生理功能，如脑的发育与成熟、血管生成、机体代谢、生殖等；同时src-1在多种疾病过程中起重要作用，如肥胖、糖尿病、血脂异常、癌症等。src-1可作为核受体共活化因子或独立的因子，通过类固醇依赖性或非依赖性途径促进癌症的发生。已有文献报道src-1在乳腺癌、肝癌和前列腺癌中高表达，促进其细胞增殖且有助于维持乳腺癌和肺癌细胞干性。rna干扰（rnai）是指一些外源性或内源性小双链rna(smallinterferingrna，sirna)在细胞内根据碱基配对原则与相应的mrna结合，诱导mrna降解，特异性、高效地阻断特定基因的表达，导致细胞出现相应基因表达缺失的技术。由于使用rnai技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。近几年来rnai研究取得了突破性进展，被《science》杂志评为2001年的十大科学进展之一并名列2002年十大科学进展之首，而且fda批准了多种sirna药物。然而，迄今为止并没有关于可抑制src-1基因表达的sirna及其在制备胶质瘤标记物和制备治疗胶质瘤药物中应用的相关报道。技术实现要素：本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可敲低src-1基因表达的sirna及其应用。本发明的技术解决方案是：一种可敲低src-1基因表达的sirna，其正义链和反义链分别如下：正义链：cagcagucauaguaauucutt；反义链：agaauuacuaugacugcugtt。一种上述可敲低src-1基因表达的sirna在制备治疗胶质瘤药物中的应用。本发明所提供的可敲低src-1基因表达的sirna，通过敲低src-1，可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和肿瘤生长且可增加胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，可作为治疗胶质母细胞瘤的一种新药。附图说明图1免疫组织化学染色分析src-1表达与临床人脑胶质瘤组织恶性等级程度的关系。图2是本发明实施例sirna敲低胶质母细胞瘤细胞中src-1表达示意图。图3是本发明实施例sirna敲低src-1表达抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和肿瘤生长示意图。图4是本发明实施例sirna敲低src-1表达增加胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。具体实施方式本发明的可敲低src-1基因表达的sirna，其正义链和反义链分别如下：正义链：cagcagucauaguaauucutt；反义链：agaauuacuaugacugcugtt。1.src-1表达与临床脑胶质瘤恶性等级程度呈正相关利用免疫组织化学的方法检测脑胶质瘤组织芯片（共59例，56例胶质瘤，3例正常脑组织）中src-1的表达情况，免疫组化结果如图1a所示。在正常脑组织中src-1表达量很低，在胶质瘤组织中src-1不同程度的高表达，而且随着胶质瘤恶性等级越高，src-1表达量越高。对56例不同恶性等级的胶质瘤src-1表达免疫组化结果进行统计，结果如图1中b柱形图所示，在高恶性程度等级脑胶质瘤（ⅲ，ⅳ）中src-1高表达的样品数所占比例（86.36%）明显高于低恶性等级脑胶质瘤（ⅰ，ⅱ，25.00%），表明src-1表达与临床脑胶质瘤恶性等级呈正相关。免疫组织化学详细步骤如下：（1）脱蜡、水化：将脑胶质瘤组织芯片浸于二甲苯i、二甲苯ii中各30min，100%乙醇i、100%乙醇ii各10min，95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各3min，蒸馏水中1min。（2）抗原修复：将待上述载玻片放入盛有适量0.01m柠檬酸缓冲液的烧杯中，煮沸20min，之后自然冷却至室温。（3）3%h2o2孵育5-10min（现配现用，甲醇稀释），之后pbs冲洗，3min×3次。（4）滴加sp-9000试剂盒a液，室温孵育10-15min，倾去，勿洗；滴加一抗src-1（1：100）抗体，4℃过夜；pbs冲洗，3min×3次。（5）滴加sp-9000试剂盒b液，室温孵育10-15mim；pbs冲洗，3min×3次。（6）滴加sp-9000试剂盒c液，室温孵育10-15mim；pbs冲洗，3min×3次，置于蒸馏水中。（7）dab显色：使用dab显色试剂盒，1mla液加1滴b液混匀，加至标本上，显色，显微镜下观察染色效果，适时终止；自来水冲洗；苏木素染色3-6min，自来水冲洗2min。（8）盐酸酒精水洗反蓝20min。（9）经过70％酒精脱水4min，85％酒精脱水2min，85％酒精脱水2min，95％酒精脱水2min，最后100％酒精脱水2min，二甲苯透明处理二次，每次10min。（10）封片。（11）显微镜观察拍照。2.sirna抑制胶质母细胞瘤细胞中src-1表达首先收集多种胶质母细胞瘤细胞系u87-mg,u251,u118,t98g,ln229以及人正常神胶质细胞，利用westernblot的方法检测这几种细胞系中src-1蛋白表达水平，westernblot结果显示如图2a，表明胶质母细胞瘤细胞系中src-1表达水平相较人正常神经胶质细胞svgp12高，进一步说明胶质母细胞瘤细胞高表达src-1。然后使用本发明的sirna（sisrc-1，上海吉玛基因公司合成），选取src-1表达较高的u251和u87mg细胞进行src-1敲低实验：瞬时转染阴性对照sirna（nc）以及本发明的sirna（sisrc-1，靶向src-1），48h后收取rna和总蛋白，检测sirna敲低src-1的效果，如图2中b、c所示。结果显示本发明实施例在rna和蛋白水平src-1表达都明显减低。上述阴性对照sirna（nc），与目的基因序列无同源性，上海吉玛基因公司合成，正义链：uucuccgaacgugucacgutt；反义链：acgugacacguucggagaatt。sirna转染步骤：a.种细胞转染前接种5×105的胶质母细胞瘤细胞于60mm细胞培养皿中，待24小时后贴壁细胞数达到60%~70%。b.转染每个培养皿各准备两个ep管，标记为a、b，分别按如下表格中体系加入各成分，各管分别轻柔混匀，室温静止5分钟：a管b管opti-mem：100μlopti-mem：100μlsirna（20μm）：5μllipofectaminetm2000：5μl将a、b两管混合轻柔混匀，室温放置20分钟后，成滴加入到已经更换为无血清和抗生素的新鲜培养基的细胞培养皿中，轻轻摇动混匀，放入co2培养箱中继续培养，8小时后更换为新鲜的完全培养基，48h后收取细胞提取rna或蛋白质进行检测src-1的表达。3.敲低src-1表达抑制胶质母细胞瘤细胞增值和肿瘤生长3.1mtt和克隆形成实验结果分别如图3中a、b、c、d所示。a、b是mtt和克隆形成方法检测u251细胞增和存活能力；c、d是mtt和克隆形成方法检测u87mg细胞增和存活能力。结果表明敲低src-1表达抑制u251和u87mg细胞的增殖和存活。mtt法检测细胞存活能力：（1）u251和u87mg细胞瞬时转染sirna（sisrc1处理组）及阴性对照sirna（nc），24h后取出细胞培养皿，吸除培养基，pbs清洗，加入1ml胰酶消化细胞。（2）终止消化，将细胞悬液移入到离心管中，1000rpm离心5min。（3）离心过程中准备好计数板，ep管，并在ep管中加入900μlpbs。离心结束后，弃上清，加入1-2ml培养基，充分混匀后取100μl细胞悬液加入ep管中混匀。取10μl稀释好的细胞悬液滴向计数板盖玻片上边缘1mm处，显微镜下计数。（4）准备96孔板，安排调零孔，阴性对照组、sisrc1处理组以及复孔（复孔设置3-4个），按照每孔细胞数为5000个，100μl每孔进行加样。在调零孔预先加入每孔100μl的培养基，并用pbs填充边缘孔。（5）将96孔板过夜培养，使其贴壁。（6）5%co2，37℃孵育24-72h，倒置显微镜下观察，加入mtt（工作浓度为0.5mg/ml）10μl每孔，37℃孵育4h。（7）吸弃上清，避光条件下每孔加入150μldmso。（8）使用od490nm波长在酶联免疫检测仪中测量各孔的吸光值。（9）细胞存活率计算公式：存活率=（od处理组-od调零孔）/（od处理组-od调零孔）。克隆形成实验：（1）u251和u87mg细胞瞬时转染sisrc1，24h后胰酶消化后吹打成单个细胞计数。（2）计数后按每孔500个细胞接种于12孔板中，每孔含1ml10%胎牛血清的培养基，轻轻晃动孔板，使细胞均匀分散于各孔。（3）待接种细胞贴壁（约24小时后），将细胞继续置于37℃含5%co2的培养箱中。（4）约7-14天后，待细胞形成肉眼可见克隆时，将细胞取出，弃培养基，pbs洗两遍，加入甲醇配制的结晶紫溶液，染色十分钟后弃去，并用流水缓慢冲洗孔板后置室温空气干燥。（5）孔板干燥后直接计数，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。3.2选取5周大的balb/cnude裸鼠进行皮下接种u251细胞，然后待肿瘤长到肉眼可见大小后分为两组，每组6只，再以瘤内多点注射的方式给予pei修饰的sirna治疗。一组给予阴性对照sirna（nc），一组给予本发明实施例靶向src-1的sirna，每周两次，每次10nmolsirna，持续注射四周。每周记录小鼠肿瘤体积，8周后牺牲裸鼠，取出肿瘤称重、固定，然后he检测肿瘤形态，免疫组化检测肿瘤src-1和pcna的表达。结果如图3e、f所示，表明敲低src-1表达明显抑制肿瘤生长和u251细胞成瘤能力。4.敲低src-1表达增加胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的敏感性选取替莫唑胺联（tmz）和sirna敲低src-1处理u251胶质母细胞瘤细胞。先将u251细胞分别转染nc和本发明实施例的sirna（sisrc-1），转染8h后消化细胞种到96孔板中，每孔5000个细胞，nc和sirna组各8个复孔，每4孔分为一组，共4组，一组nc组，一组nc+tmz组，一组sisrc-1组，一组si-src-1+tmz组，tmz表示给予替莫唑胺处理，48h后利用mtt法检测增殖能力，结果如图4所示。结果表明相对单独加药组，sirna敲低src-1后在500μm和1000μm的替莫唑胺浓度时都能更好的抑制u251细胞增殖，表明sirna敲低src-1能增强临床药物替莫唑胺对胶质母细胞瘤的敏感性。序列表<110>大连医科大学<120>可敲低src-1基因表达的sirna及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna/rna<213>人工序列(类固醇受体共活化因子)<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<400>1cagcagucauaguaauucutt21<210>2<211>21<212>dna/rna<213>人工序列(类固醇受体共活化因子)<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<400>2agaauuacuaugacugcugtt21<210>3<211>21<212>dna/rna<213>人工序列(类固醇受体共活化因子)<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<400>3uucuccgaacgugucacgutt21<210>4<211>21<212>dna/rna<213>人工序列(类固醇受体共活化因子)<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<400>4acgugacacguucggagaatt21当前第1页12